猪圆环病毒2型青海分离株的分子鉴定及进化分析

赵玉清

（青海省海北藏族自治州畜牧兽医科学研究所，青海海北 812200）

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）的DNA病毒，其基因组为环状单链DNA分子，长度约1 767 bp，主要有Rep和Cap两个基因完成病毒的复制组装等功能[1-2]。PCV有多种血清型，如PCV1、PCV2和PCV3型等。其中：PCV1无致病性；PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning pigs multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要毒株[3-4]；PCV3是在美国首先报道发现的新毒株，能引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，目前在我国河北、福建、广西等多个省份都能检测到，与PCV1和PCV2处于不同的进化分支，属于新型PCV[5-8]。

PCV主要通过垂直传播（透过胎盘屏障）和水平传播（通过阳性带毒猪的鼻腔液、粪便和尿液等排泄物）而感染其他猪群[9-10]。血清流行病学调查发现：德国猪群的PCV血清抗体阳性率高达85%，英国为86%，北爱尔兰为92%；我国江西、天津、北京、山东、河南、河北、吉林、福建等8个省份猪群的抗体阳性率都在50%以上[11-13]。可见，PCV在全球流行广泛，给养猪业造成了巨大经济损失。

本研究对青海省不同猪场发病猪群样品，通过PCR检测PCV2 ORF2基因，分析基因序列、氨基酸序列和进化树，从而为我国PCV感染的诊断、预防控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料与毒株

采自青海省3个猪场的发病猪群。对表现呼吸困难、咳嗽、精神沉郁、行动迟缓、皮肤苍白、被毛脏乱、厌食消瘦、生长迟缓的猪进行剖检，采集剖检猪的淋巴、脾脏、肾脏和肝脏组织。每个猪场采集样品6份，共18份样品，用PBS液匀浆离心（5 000 r/min，20 min）取上清，-80 ℃保存备用。

1.2 主要试剂与仪器

PCR-Premix Taq™（TaKaRa Taq™ Version 2.0 plus dye）和DNA marker DL 2000：购于宝生物工程（大连）有限公司；粪便基因组DNA提取试剂盒：购自天根生化科技（北京）有限公司。其他均为国产常规试剂。PCR引物合成及PCR产物测序，均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。主要仪器包括PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、离心机、电子天平、蒸汽灭菌器、干燥箱、无菌操作台、微量移液器等。

1.3 分子鉴定

参照粪便基因组DNA提取试剂盒说明书，提取粪便基因组DNA并以此作为模板。VP2基因扩增全长片段预期为702 bp。引物如下：PCVCapF：5'- ATGACGTATCCAAGGAGGC-3'和 PCVCapR：5'- TTAGGGTTTAAGTGGGGGGT-3'。PCR扩增反应体系（50.0 μL）如下：Premix Taq 25.0 μL，上下游引物（浓度 10.0 μmol/L）各 2.0 μL，模板 DNA 3.0 μL，补充水 18.0 μL。扩增后将PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳（电压120 V，时间30 min），电泳完成后在凝胶成像仪中观察结果并拍照。PCR阳性产物测序委托金唯智生物科技有限公司完成，采用Sanger双脱氧链终止法进行双向测序。测序结果经峰图分析后，在GenBank上采用BLAST方法（https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）进行同源序列搜索；应用MEGA 5.0软件和Clustal Omega在线软件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）进行核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析。

1.4 PCV2-Cap蛋白特性分析

利用Prot Param程序（http://web.expasy.org/protparam/）计算VP2蛋白的分子量、等电点和氨基酸组成等理化指标；用SignalP程序（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和DAS-TMfilter server程 序（http://mendel.imp.ac.at/sat/DAS/DAS.html）分析其信号肽位点及跨膜结构；用SOPMA软件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html）进行EM19抗原蛋白二级结构预测。通过ABCPred软件（http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html）对VP2蛋白的B细胞抗原表位进行预测分析。

1.5 进化分析

对克隆的PCV-Cap基因序列与已发表的PCV1和PCV2参考株的Cap基因序列和氨基酸序列，利用软件中的 Meg Align 功能分别进行比对；利用MEGA 5.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树；选择Kimura 2-parameter模式，进行重复2 000次的自举检验，通过系统发育树分析PCV分离毒株和不同经典毒株的亲缘关系及进化特点。

2 结果

2.1 分子鉴定

利用基因组DNA提取试剂盒，对病料提取DNA后，基于特异性引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，可以获得预期大小的片段（图1），并发现有4个组织样品呈阳性，阳性率为22.2%（4/18）。将4个阳性样品进行胶回收测序，经过序列测定获得完整的Cap基因核苷酸序列全长为705 bp，与GenBank参考毒株（PCV2）的核苷酸序列同源性均在99%以上，将其命名为PCV2-QH1株。

图1 临床病料样品PCV-Cap基因PCR扩增检测鉴定结果

2.2 PCV2-Cap蛋白特性

经过ExpASy在线系统分析，PCV2-Cap蛋白长度为234个氨基酸，分子量大小约为28.06 kDa，等电点（pI）为10.84；带正（Arg+ Lys）负（Asp + Glu）电荷氨基酸残基数分别为41个和16个。假定所有的半胱氨酸都形成二硫键，PCV2-Cap蛋白在280 nm处的摩尔消光系数为48 360 L·mol-1·cm-1及 0.1% 浓度（1g/L）的Abs值为1.724；假定所有的二硫键打开时，蛋白在280 nm处的摩尔消光系数为 48 360 L·mol-1·cm-1及 0.1%浓 度（1g/L） 的 Abs值 为 1.724。PCV2-Cap蛋白在溶液中的不稳定指数为56.61，推测PCV2-Cap蛋白为不稳定蛋白。PCV2-Cap蛋白的脂肪族指数为65.30，亲水性平均系数（GRAVY）为-0.844，蛋白总体亲水性非常高，可溶于水。PCV2-Cap蛋白序列信号肽预测值为0.182（cutoff值为0.450），不具有信号肽位点；软件DAS-TMfilter server也显示其不具有潜在的信号肽。PCV2-Cap蛋白二级结构预测分析发现，α螺旋比例为7.26%，β转角比例为4.70%，无规则卷曲比例为61.54%，延伸链比例为26.50%。可见，PCV2-Cap蛋白的二级结构以无规则卷曲为主。根据ABC Pred在线软件预测出抗原表位结果见表1，有多个有效的抗原表位。

2.3 PCV-Cap基因进化关系分析

通过Clustal Omega软件，将分离毒株PCV2-QH1的Cap基因与GenBank中相关毒株Cap基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较，发现核苷酸同源性均在99%以上，氨基酸序列同源性均为100%，无氨基酸突变（表2）。进化树分析发现，PCV-QH1分离株与PCV2美国分离株（KU697156）组成一个微小分支，并与其它PCV2分离株处于同一个大支上，从进化角度上鉴定此分离株属PCV2株（图2）。

3 讨论与结论

PCV对养猪业造成了巨大危害，除了引起断奶仔猪多系统衰竭综合征外，还能造成猪生殖系统紊乱、神经系统病变和呼吸道疾病综合征，以及肠炎和增生性坏死性肺炎，也能引起猪皮炎肾病综合征等[14]。已有研究表明，猪群除了会同时感染不同基因型的PCV（PCV1，PCV2a/b）外，还会与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒等形成共同感染[15]，对于属单链DNA病毒PCV基因组中的基因易造成突变、插入和缺失等变异现象；同时随着各种疫苗的大规模普遍使用，新的变异重组毒株可能经常出现。

表1 基于ABCPred软件分析PCV2-Cap蛋白B细胞抗原表位结果

表2 PCV2-QH1与不同毒株Cap基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较 单位：%

图2 猪圆环病毒PCV-Cap基因的进化分析

临床实践中，从猪组织细胞中纯化分离培养PCV较困难，所以本研究对疑似PCV感染组织病料直接进行DNA基因组的提取及PCV特异性引物的筛选鉴定，通过测序确定为PCV2。该方法适用于分子流行病学调查研究，有助于基因和蛋白序列比较及遗传进化分析，同时可节省时间。

本研究表明，PCV2-Cap基因核苷酸序列与不同国家或地区的同源性均在99%以上，而蛋白序列同源性均为100%，无氨基酸突变。PCV2-Cap蛋白为病毒的衣壳蛋白，是主要的结构蛋白，也是主要的抗原表位。本地区PCV的Cap蛋白的氨基酸序列无突变，说明使用市场通用疫苗可收到良好的免疫效果。

同时，本研究对不同地区的PCV分离株进行了序列比较分析，并绘制了系统进化树。结果表明，青海株（PCV-QH1）与美国3株毒株、韩国毒株聚在一支，表明它们之间的亲缘关系最近；我国不同地区的毒株聚在一起，同时与韩国毒株亲缘关系较近。欧洲毒株（法国和英国）与印度毒株亲缘关系较近，澳大利亚毒株和日本毒株分别聚在一起，亲缘关系较近。在进化角度上讲，中国株与韩国株和美国株的亲缘关系较近，说明中国株PCV病毒不是从单一的祖先进化而来的。这表明中国株与我国的国际进口引种贸易相关，但尚待进一步研究。本次对青海PCV分离株的Cap基因序列、蛋白氨基酸序列和抗原表位及系统进化的研究，可为我国PCV分子流行病学调查提供数据参考，同时提示猪场应按照疫苗免疫保健计划进行疫苗免疫预防。