西伯利亚蝗越冬卵的发育特征及胚胎发育规律

闫蒙云，何立志，王 晗，于 非，何 岚，袁 亮，廖成敏,刘余平，李占武，季 荣，叶小芳

(1.中亚区域跨境有害生物联合控制国际研究中心，新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室，新疆师范大学生命科学学院,新疆 乌鲁木齐 830054； 2.新疆维吾尔自治区哈密地区蝗虫鼠害预测预报防治站，新疆 哈密 839000)

西伯利亚蝗(Gomphocerussibiricus)属直翅目(Orthoptera)、槌角蝗科(Gomphoceridae)，大足蝗属，国外分布于俄罗斯西伯利亚和蒙古，国内在新疆、内蒙古和黑龙江等地均有分布[1]。作为新疆的优势种蝗虫，西伯利亚蝗对当地的草地及农作物危害极大[2]。西伯利亚蝗一年发生一代，自蝗卵产下埋于土壤5 cm深处至孵化约需9个月[3]。由于新疆冬季寒冷且漫长，低温是蝗卵越冬存活的主要威胁，胚胎发育情况直接决定次年蝗卵的孵化及蝗虫的发生程度。

有关蝗虫较为系统的研究多见于沙漠蝗(Schistocercagregaria)、东亚飞蝗(Locustamigratoriamanilensis)、澳大利亚灾蝗(Chortoicetesterminifera)和异黑蝗(Melanoplusdifferentials)，除对胚胎发育进行形态描述和阶段划分外[4-5]，在胚胎发育过程中的生理生化物质[6-9]、神经分化[10]、基因表达和蛋白质合成调控[11]等方面也有研究。有关西伯利亚蝗的研究主要集中在成虫体内生理生化物质、呼吸代谢水平以及相关酶活性的研究[12-14]，对蝗卵的研究较少，且只报道了蝗卵的发育起点温度和有效积温[15]，而其胚胎发育情况尚未明确。西伯利亚蝗以卵在土壤中越冬，蝗卵无法通过活动主动躲避恶劣环境，因此受外界环境影响更为严重[16]，且在长时间的越冬过程中，蝗卵的形态会发生一系列变化[17]。为明确西伯利亚蝗的胚胎发育特征，比较恒温条件下和自然条件下胚胎发育的差异，本研究采用体式显微镜观察恒温条件下蝗卵整个发育过程的胚胎形态并进行阶段划分，跟踪调查自然条件下的胚胎发育进度。同时，采用扫描电镜观察卵壳的超微结构，以阐明西伯利亚蝗卵的胚胎发育规律，也有助于从蝗虫的卵期寻找突破口，探索有效防控蝗虫的新途径。

1 材料与方法

1.1 蝗虫饲养和虫卵收集

2015-2016年连续两年，于西伯利亚蝗发生期间(6月15日-8月5日)，采集雌、雄成虫饲养于1 m3大小的正方体笼中。以当地优势植物天山赖草(Leymustianschanicus)和针茅(Stipacapillata)等作为蝗虫的主要食物，间或以播种的新鲜小麦(Triticumaestivum)苗作为补充。笼子底部放置育苗盆，覆盖5 cm厚的松软土壤并喷水保持一定湿度，供雌虫产卵。每天18:00收集卵囊置于带孔的塑料盒里，并埋于蝗卵收集处附近的野外土壤中，同时记录卵囊数。

1.2 恒温条件下蝗卵的胚胎发育观察

滞育前发育：取同一天蝗虫新产卵分置于10个饲养盒中，每盒15个卵囊，盒内盛满蛭石(相对含水量为40%)，转移至(30±1) ℃的人工气候箱中(RTOP-403B1，浙江拓普)，每天分别于10: 00和22:00调查两次，并通过加湿器及时补充丧失的水分。取样观察：选取10粒饱满健康蝗卵，用Bouin′s液固定24 h后，以70%酒精溶液清洗蝗卵3次。取出蝗卵置于10%次氯酸钠溶液中处理4 min，待卵外壳变薄且透明后，0.75%盐水清洗3次。观察时，将卵置于尼康实体显微镜(EX 20，宁波舜宇)下用解剖针解剖出胚胎，0.75%盐水清洗残存的胚胎卵黄，最后向胚胎表面滴加少许酒精，并对胚胎正面、侧面和背面进行拍照，观察记录胚胎在卵中的位置、方向和发育特征。

蝗卵滞育解除：将滞育卵置于5 ℃低温箱中储存180 d以解除滞育。翌年2月20日将低温处理过的蝗卵重新放回(30±1) ℃人工气候箱中，此时大部分蝗卵已经解除滞育，解剖观察方法同上。

根据胚胎的形态、躯干与附肢的分节、胚胎在卵中的位置等特征对西伯利亚蝗的胚胎发育进行阶段划分[18-22]。

1.3 自然条件下越冬卵的胚胎发育观察

为明确越冬卵在自然条件下的胚胎发育情况以及滞育后恢复发育的时间，于2015年8月-2016年4月期间每月10日和25日各取蝗卵10粒，解剖观察其胚胎发育形态特征，以确定所处阶段。蝗卵解剖方法同1.2。同时采用电子温度记录器(TP-2200，北京安伏)逐日测定自然条件下蝗卵整个越冬过程(2015年8月-2016年4月)5 cm的土层地温，掌握不同月份间的温度变化。

1.4 自然条件下越冬卵卵壳超微结构观察

2015年8月-2016年3月越冬期间，每月20日取西伯利亚蝗卵10粒，采用扫描电镜(JEOL JSM-6390LV，日本电子株式会社)观察卵壳的超微结构。具体方法：将取好的新鲜蝗卵用生理盐水或磷酸缓冲液冲洗干净后，迅速放入4%戊二醛固定液中固定1 h，用磷酸缓冲液冲洗3次，每次15 min，用液体叔丁醇50%、70%、80%、90%、100%逐级梯度脱水，每次5 min。放入冷冻干燥仪(JFD-320、宁波市双嘉仪器有限公司)中干燥，待干燥后的样品温度升到室温后取出，将样品用导电胶贴在样品托上，放离子溅射仪(JFC-160，必和国际贸易有限公司)中镀膜，用扫描电镜观察并拍照。

2 结果

2.1 西伯利亚蝗的胚胎发育阶段划分

刚产出的蝗卵，30 ℃恒温条件下第2天即可观察到胚胎。西伯利亚蝗胚胎发育可划分为12个阶段(图1)，滞育发生在Ⅷ阶段，滞育时间约为193 d。各阶段指标变化如表1所列。

第Ⅰ阶段：发育2 d(自放入30 ℃恒温条件起开始计时，下同)。胚胎紧贴在卵孔端，位于卵腹面的卵黄表面，原头与原颚胸折叠(图1A)。

图1 西伯利亚蝗的胚胎发育阶段Fig. 1 Developmental stages of G. sibiricus embryos

指标 Parameter 发育阶段Development stageⅠⅡ Ⅲ ⅣⅤ Ⅵ Ⅶ ⅧⅨⅩⅪⅫ原头Procephalon++ 原躯干Truncus++原颚Protomala++胸部Thorax + + 腹部Abdomen + 胸部附肢Thoracic appendages + + + + + 腹部附肢Abdominal appendages++ 后足Metathoracic leg+++复眼Ommateum+++++唇基Clypeus + + + + + + +触角Antennae++++++++原肛Proctodeum ++尾须Cercus ++外生殖器Genitalia ++胚动Blastokinesis +

+表示该指标出现或有变化。

+ indicate that the index has appeared or changed.

第Ⅱ阶段：发育3 d。原头与原躯干略呈90°直角。躯干未出现分节的迹象(图1B)。

第Ⅲ阶段：发育4 d。原躯干部分开始分化为原颚和原胸两部分。原头两侧开始出现复眼的轮廓，原颚部分未明显分节，原胸部分可分为3节(图1C)。

第Ⅳ阶段：发育5-6 d。胚胎原头部可见分化出的触角和上唇芽基。躯干部分进一步分化为原颚、胸和腹部3部分。颚、胸部各分为3节，可见分化出的附肢。腹部细长已分节，但未出现腹部附肢。该阶段为胚胎发育的原足期(图1D)。

第Ⅴ阶段：发育7-10 d。上唇和触角继续生长增大，胸部附肢继续生长，原颚部的第1对附肢分化为上颚；下颚芽基分为3部分，最外侧为下颚须，中间为盔节，最内侧为叶节；下唇芽基分为2部分，外侧为下唇须，内侧为侧唇舌。胸部附肢继续生长；腹部明显分为11节，各体节出现1对附肢，腹部末端第11腹节的末端中央部分出现原肛。该阶段为胚胎发育的多足期(图1E)。

第Ⅵ阶段：发育11-14 d。原头两侧复眼基本形成，并开始出现色素。触角伸长，分节不明显。上唇和原鄂部各芽基继续增大。胸部附肢开始出现分节，腹部附肢开始退化(图1F)。

第Ⅶ阶段：发育15-20 d。触角继续伸长，上唇呈梨形位于触角之间。胸部附肢分节清晰，除与身体相连的基节外，可分为腿节、胫节和跗节。腹部分节明显，除第1腹节附肢外，其余基本退化。原肛内陷明显。该阶段为胚胎发育的寡足期(图1G)。

第Ⅷ阶段：进入滞育期(21-214 d)。与第Ⅶ阶段相比，复眼、触角、上唇和附肢等变化明显，复眼出现红色的色素，触角伸长，上唇分为2节，前端尚未纵裂。胸部附肢继续生长，后足跗节隐约分为3节，腹部分节清晰(图1H，I)。此后，胚胎发育停滞，胚胎形态维持不变。将此阶段的蝗卵置于5 ℃保存约6个月以解除滞育。

第Ⅸ阶段：滞育解除后，发育215 d。此时为胚胎旋转时期，胚胎在卵内的形态变化较大。胚胎背面弯曲，原头弯向卵中央。胚胎完成旋转后，原头由原来的卵孔方向转为卵前端指向(图1J，K)。

第Ⅹ阶段：发育216～217 d。旋转完成后，胚胎约占卵3/4大小，大部分卵黄被包裹进胚胎，最终变为胚胎组织，胚胎开始背合。复眼颜色加深，上唇和触角几乎遮盖了叶节、下唇和下唇须。下颚的大部分被上颚遮盖，头部形成。胸部附肢继续生长，腹部末端开始发育出尾须及外生殖器(图1L，M，N)。

第Ⅺ阶段：发育218～219 d。胚胎占据全卵，卵黄全部包裹进胚胎，背部可见一纵沟，背合即将完成。触角可清晰分为10节，上唇分为两节，前端纵裂为两瓣。胚胎表面出现色素积累(图1O，P)。

第Ⅻ阶段：发育220 d。胚胎表面色素积累进一步加深，复眼颜色更深，触角分节更加明显。后足腿节上的羽毛状花纹清晰可见，胫节刺出现，跗节分为4节，后足腿节顶端已达到第7腹节。胚胎背合完成，外生殖器和尾须明显可见，亟待孵化(图1Q，R)。

2.2 自然条件下越冬卵的胚胎发育进程

新产蝗卵在适宜条件下开始生长发育，逐渐形成胚胎各外部器官的前体芽基。8月胚胎变化较大，头、胸、腹和附肢等结构分化完全(图2 A,早期胚胎)。9月胚胎继续生长(图2B)，处于胚胎发育第Ⅶ阶段。9月末-10月上旬，蝗卵逐渐进入滞育，以第Ⅷ阶段越冬，直至翌年2月。在此期间，胚胎结构变化不明显，发育基本停滞(图2C-G)。越冬期间，2月平均温度最低(-8.4 ℃)(表2)；3月温度上升，胚胎出现胚动现象，肢体运动频繁(图2H)，此时胚胎发育处于第Ⅸ-Ⅹ阶段。4月胚胎发育渐至成熟，处于第Ⅺ-Ⅻ阶段，身体表面色素出现，附肢开始变黑硬化，亟待孵化(图2I)。自然条件下，2015年9月25日发育至第Ⅷ阶段，进入滞育，2016年3月10日发育至Ⅸ阶段，滞育解除，滞育时间约为166 d。

图2 2015年8月-2016年4月西伯利亚蝗越冬卵的胚胎发育Fig. 2 Embryonic development of Gomphocerus sibiricus eggs from August 2015 to April 2016

观察日期Date of observation/(MM-DD)发育阶段Developmental stage总数Total样本数Number of samples月均温 Monthly temperature/℃08-25Ⅵ101024.709-10Ⅵ303Ⅶ70714.609-25Ⅶ202Ⅷ80810-10Ⅷ1001010.810-25Ⅷ1001011-10Ⅷ100123.611-25Ⅷ1001012-10Ⅷ10010-3.312-25Ⅷ1001001-10Ⅷ10012-4.801-25Ⅷ1001002-10Ⅷ10010-8.402-25Ⅷ1001003-10Ⅷ606Ⅸ40415.203-25Ⅹ1001004-05Ⅺ 1001004-10Ⅻ1001017.104-25Ⅻ100 10

2.3 自然条件下越冬卵的卵壳超微结构变化

蝗卵一端钝圆，一端呈狭圆状。采用扫描电镜对蝗卵气孔进行超微结构观察发现，蝗卵的气孔位于狭圆状后端。8月处于胚胎发育的第Ⅵ阶段，此时为胚胎发育的活跃时期，孔洞状开口较为明显，开度较小(图3A)；9月的围壁较8月低，开度较8月大(图3B)，此时处于胚胎发育的第Ⅶ或第Ⅷ阶段。此后直至翌年3月，胚胎以第Ⅷ阶段越冬；10月围壁逐渐降低，气孔开度有所减小(图3C)；11月围壁变化与10月类似(图3D)；12月气孔开度减小，围壁降低(图3E)；次年1月围壁持续降低，气孔开度较12月大(图3F)；2月围壁几乎消失，气孔开度最大(图3G)；3月又恢复为近似原有的围壁结构，孔洞状开口明显，气孔开度减小(图3H)，此时已有部分胚胎发育至第Ⅸ阶段。与气孔相对的另一端(前端)具有清楚的由六边形相连构成的网状结构，并逐渐向卵孔端延伸，且逐渐模糊(图3I)。

图3 2015年8月-2016年3月西伯利亚蝗越冬卵的卵壳超微结构Fig. 3 Eggshell ultrastructure of overwintering eggs in Gomphocerus sibiricus for August 2015 to March 2016

3 讨论

3.1 西伯利亚蝗的胚胎发育阶段划分

蝗虫种类不同，其胚胎发育过程的阶段划分也不一致。根据形态特征，Salzen[23]将东亚飞蝗的胚胎发育划分为13个阶段，Tyrer[24]将沙漠蝗的胚胎发育划分为16个阶段，钦俊德等[16]将亚洲飞蝗(Locustamigratoria)的胚胎发育划分为10阶段，陈伟等[19]将越北腹露蝗(Fruhstorferiolatonkinensis)的胚胎发育分为10个阶段，崔双双和朱道弘[20]将中华稻蝗(Oxyachinensi)的胚胎发育划分为11个阶段，赵琴和贺一原[21]将黄脊竹蝗(Rammeacriskiangsu)的胚胎发育划分为11个阶段，任金龙等[22]将意大利蝗(Calliptamusitalicus)胚胎发育划分为18个阶段。本研究中，30 ℃恒温条件下，将西伯利亚蝗的胚胎发育划分为12个阶段。其中，第Ⅰ-Ⅷ阶段，主要以胚胎分节和附肢特化来区分；第Ⅸ阶段以胚动来区分；第Ⅹ-Ⅻ阶段以胚胎位置和胚胎大小来区分。与其他蝗虫相似，西伯利亚蝗也是以胸部为中心进行体节建成，属短胚带昆虫[5,22]。

昆虫种类和生活环境不同，其胚胎发育过程耗时长短也有差异。越北腹露蝗卵由于受到生理滞育的影响，越冬期间的滞育期长达180 d，孵化约需206 d[19]。亚洲飞蝗胚胎发育无滞育现象，30 ℃条件下，经13 d就能孵化[16]。本研究中，30 ℃恒温条件下西伯利亚蝗卵孵化需220 d，其中滞育期长达193 d，第Ⅸ阶段胚胎出现胚动现象，滞育解除。通常认为，胚动主要与胚胎卵内营养物质的充分利用有关，可使胚胎在卵内得以充分发育[25-26]。西伯利亚蝗的胚转完成后，卵黄大部分被包裹进胚胎内，这表明胚动有助于胚胎吸收卵内营养物质，确保胚胎正常发育。

3.2 自然条件下越冬卵与室内恒温培养蝗卵的胚胎发育比较

在长期进化过程中，不同种类昆虫逐渐形成了独特的越冬机制。昆虫是变温动物，其发育和存活受温度影响和控制[27-28]。为适应环境变化，昆虫出现了独特、持续的滞育现象。滞育不仅是昆虫度过不利环境的重要生存策略之一，而且对种群存活、生长和繁殖意义重大[29-32]。昆虫进入滞育到滞育解除的过程称为滞育发育(diapause development)，一般可分为诱导、维持和解除3个阶段[33]。本研究发现，西伯利亚蝗以卵越冬，存在滞育现象，且蝗卵不是完全同步发育，进入滞育的时间也不完全一致。西伯利亚蝗卵在9月末(越冬前)开始进入滞育，平均温度为14.6 ℃，越冬期间胚胎发育停滞在第Ⅷ阶段。来年3月滞育解除，平均温度为15.2 ℃，胚胎发育逐渐恢复。滞育期间(9月末-次年3月)的月平均温度均低于滞育前和滞育后，由此推测，蝗卵胚胎发育与其周围环境温度有关，具体机制还有待进一步深入研究。

任金龙等[22]研究发现，意大利蝗在恒温32 ℃条件下，蝗卵的滞育时间为270 d，自然条件下蝗卵滞育时间最长约为202 d，恒温条件下蝗卵的滞育时间大于自然条件蝗卵的滞育时间。本研究中，恒温30 ℃条件下蝗卵滞育时间约为193 d，大于自然条件下蝗卵滞育时间(约166 d)这与意大利蝗的滞育特性一致。意大利蝗在两种环境下的滞育时间均大于西伯利亚蝗的滞育时间，其可能原因是意大利蝗和西伯利亚蝗的生境不同，尤其是温度的差异可使蝗卵所受热量不同，从而导致滞育的维持时间及所处阶段亦不同。西伯利亚蝗的滞育特性，可抑制蝗卵在秋末的发育，利于蝗卵抵御低温环境，保证其安全越冬和来年的种群数量[34]。因此，利用西伯利亚蝗卵的滞育特性，寻求解除或打破蝗卵滞育的途径，可以降低其越冬存活率及孵化率，从而在卵期对其进行有效防控。

3.3 自然条件下越冬卵卵壳超微结构变化

卵壳是昆虫卵防御外界不良环境的重要屏障，与胚胎发育直接相关[35]。卵壳上的气孔是其重要的呼吸机构[36]，既可为蝗卵发育提供充足的氧气，又可防止水分蒸发散失，保证蝗卵正常的水分需求。不同种类昆虫的气孔直径不同，通过气孔的气体体积也有差异，但可满足胚胎正常发育的需要。本研究发现，8-10月，西伯利亚蝗处于早期胚胎发育时期，蝗卵气孔孔洞状开口较为明显，开度较小。11月-翌年2月，蝗卵进入滞育，胚胎发育无明显变化，气孔围壁降低，开度增大。翌年3月，胚胎滞育解除，孔洞状开口恢复为原有状态。在气孔的结构变化中可看出气孔围壁大小随着越冬时间的推进呈逐渐降低的趋势，气孔开度逐渐增大，但在次年滞育解除后又逐渐恢复原状态。此外，随着时间推进，卵壳的韧性逐渐降低，越接近蝗卵孵化期，其韧性越差，甚至自动脱落。因此推测，气孔围壁的变化与胚胎发育之间有一定关系。明确西伯利亚蝗的胚胎发育规律及卵壳的结构变化，有利于增加对蝗卵滞育特性的理解，这不仅为阐明蝗卵的抗寒及滞育机制提供了科学依据，而且对提高西伯利亚蝗的防治效率也具有重要意义，但关于胚胎发育过程的基因调控和蛋白表达等分子机制还需进一步研究。