生物污泥对草地早熟禾耐旱及细胞抗氧化能力的影响

于安东，于芳芳，滕 珂，常智慧

(1.北京林业大学草坪研究所，北京 100083； 2.北京草业与环境研究发展中心，北京 100097)

生物污泥是污水处理过程中产生的固体有机物，含有丰富的氮、磷等营养物质，可以应用于农业及园林绿化，实现其资源化利用[1]。污泥的土地利用可以有效改良土壤的有机质含量、土壤结构等理化性质，同时可以增强土壤中微生物的活性[2-3]。近年来，有研究发现，污泥可以提高草坪草抵御环境胁迫的能力,如干旱、寒冷、高温等[4-5]。

除基本营养物质外，生物污泥中富含腐殖质、氨基酸、维他命等多种生物活性物质[6]，这些物质可能通过直接提供植物生长调节剂，促进与激素相关的微生物的活动，进而提高作物产量[7]。目前生长素和腐殖酸已被证明能促进高羊茅(Festucaarundinacea)根系的生长，并提高其坪观质量[8]。有研究发现，在根围的激素能够促进草坪草的生长，并且单独施加矿质营养不能替代这些物质的生物作用，而污泥提取物中的腐殖质有类似激素的作用[9]。同时施用污泥可以减缓草坪草中氮素等营养物质的释放，使草坪草的细胞膜透性降低，提高其抗寒性[10]。

草坪草能通过提高其抗氧化酶防御系统活性消除干旱诱导的氧化反应，提高草地早熟禾的抗氧化剂活性能显著增强其耐旱性[11]。研究表明，干旱条件下污泥处理能增加苜蓿(Medicagosativa‘Aragón’)植株的含氮化合物水平，这种氮代谢反应与酶活性变化密切相关[12]。通过施用外源植物生长调节剂，匍匐剪股颖(Agrostisstolonifera)植物体内的超氧化物歧化酶(SOD)活性和草坪的坪观质量均明显增加[13]。干旱胁迫下生长素和细胞分裂素可作为信号分子，启动SOD等防御化合物上调的代谢机制，且植物叶片中的生长素和细胞分裂素含量在施用污泥后显著升高。也有试验表明，正常生长条件下施加风干污泥可明显提高黑麦草(Loliumperenne)和高羊茅叶片过氧化物酶(POD)及过氧化氢酶(CAT)活性[14]。

草地早熟禾(Poapratensis)是一种喜冷凉湿润、草坪质量高的冷季型草坪草，在园林绿化、各类球场中广泛应用。但草地早熟禾不耐高温、抗旱性差，目前的研究表明，污泥可以促进草坪草生长，但有关污泥提高草地早熟禾抗氧化酶活性及抗旱性方面的研究较少[15-16]，有待深入研究。为此，以污泥和硝酸铵作为氮源，无氮Hoagland营养液提供植物生长所需的其他营养元素，研究污泥对草地早熟禾抗氧化酶活性和耐旱性的影响，为深入研究污泥提高植物的抗性机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验污泥取自北京市某污水处理厂的脱水泥饼，送至北京市农林科学院植物营养与自然资源研究所测定其理化性质(表1)。

表1 试验污泥的理化性质Table 1 Tested biosolid properties

试验采用草地早熟禾品种为午夜(Midnight)，基质选用煅烧粘土(购于美国Profile公司)，不含任何营养物质。

1.2 生物污泥中有效氮含量测定

试验在温室中进行，日夜温度为23 ℃/16 ℃，光照11 h，光强为860 μmol·(m2·s)-1。草地早熟禾采用盆栽方式(盆直径15 cm、深度10 cm)，每盆装700 g煅烧粘土。草地早熟禾品种‘Midnight’播种量为15 g·m-2，试验期间土壤的田间持水量保持在90%。

试验采用完全随机区组设计，设5个处理：1)对照，不添加氮；2)硝酸铵施用量25 mg·kg-1； 3)硝酸铵施用量50 mg·kg-1；4)硝酸铵施用量75 mg·kg-1；5)施用污泥15 g·pot-1。每个处理设4个重复。整个试验期间草地早熟禾生长的氮素来源为污泥或硝酸铵，添加足量无氮Hoagland营养液提供草地早熟禾生长所需的其他营养元素。

草地早熟禾生长期为8周，试验期间定期修剪叶片使高度维持在8～10 cm，修剪后收集草屑，在60～65 ℃烘箱中烘干至恒重。最后一次修剪将地上部分收集并烘干，与前期修剪的叶片样品混合。用凯氏定氮法[17]测定每盆草坪草地上部分的全氮含量，得出每个处理组平均每千克土壤的氮摄入量。依据所得数据，做出草地早熟禾氮摄入量(g·kg-1)与氮施用量(mg·kg-1)的线性方程：y=0.002 2x-0.000 5(图1)。由此计算出15 g污泥中可提供的有效氮含量是113.2 mg ·kg-1，即试验提供75 mg·kg-1有效氮，则每千克土壤需添加14.2 g污泥。

图1 草地早熟禾植株有效氮含量测定标准曲线Fig. 1 Standard curves of plant-available nitrogen content determination in Poa pratensis

1.3 试验设计

草地早熟禾生长条件同上述试验，塑料盆(直径21 cm、深度18 cm)，每盆装2.5 kg的煅烧粘土。

试验采用裂区设计，主处理为浇水机制：充分浇水和干旱处理2个水平。副处理为氮素来源，包括3个处理：1)对照(硝酸铵提供75 mg·kg-1的氮素)；2)半污泥(硝酸铵和污泥各提供37.5 mg·kg-1的氮素)；3)全污泥处理(污泥提供75 mg·kg-1的氮素)。每个处理设5个重复。播种前将试验所用污泥与基质混匀；硝酸铵均分3次于播种前1 d、播种后2周和4周施入。

播种4周后开始干旱处理，充分浇水处理保持90%的田间持水量，干旱处理组从6月17日开始，自然干旱至50%田间饱和持水量、35%田间饱和持水量、25%田间饱和持水量，而后恢复充分浇水至90%田间饱和持水量。叶片取样时间为干旱处理组田间饱和持水量90%(6月17日)、50%(7月2日)、35%(7月9日)、25%(7月20日)、复水7 d(7月27日)，即轻度、中度、重度、极度干旱以及复水状态，试验结束时采集草坪草的根样。

1.4 测定指标及方法

草坪坪观质量、叶片萎蔫度采用目测法[12,18]；叶片相对含水量参照饱和称重法[19]并做适当修改；收集及测定根重采用Zhang等[8]的方法；可溶性糖含量采用蒽酮比色法[20]测定；丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸比色法[20]；超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性参照Nakano和Asada[21]的方法测定；抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化物酶活性参照Maehly和Chance[22]的方法测定。

1.5 数据分析

采用SPSS 23软件进行试验数据分析；统计检验采用LSD检验(0.05水平最小显著差异法)。

2 结果与分析

2.1 坪观质量

两种水分条件下草地早熟禾的坪观质量随时间推移均呈现下降趋势(表2)。充分浇水条件下，半污泥处理的叶片坪观质量在第一次取样时与对照差异显著(P<0.05)，全污泥处理后坪观质量前3次取样时与对照相比均显著提高(P<0.05)。

干旱条件下，全污泥处理在7月2日(50%田间持水量)、7月9日(35%田间持水量)、7月27日(复水7 d)坪观质量分别为7.8、7.4和7.8，且半污泥处理在重度干旱(35%田间持水量)与极度干旱(25%田间持水量)时叶片坪观质量达到7.3及5.7，与对照相比均显著提高(P<0.05)，但全污泥和半污泥处理间坪观质量无显著差异(P>0.05)。

表2 草地早熟禾的草坪坪观质量变化Table 2 Changes in turfgrass quality in Poa pratensis

同列不同小写字母表示同一水分处理不同污泥处理间差异显著(P<0.05)，同行不同大写字母表示不同取样日期间差异显著(P<0.05)，下同。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference for the same moisture treatment between different biosolid treatments at the 0.05 level, different capital letters within the same row indicate significant differences for the same treatment between different sampling dates at the 0.05 level; similarly for the following tables.

2.2 叶片萎蔫度

充分浇水条件下草地早熟禾叶片未发生萎蔫现象(图2)。干旱条件下，随干旱程度增加，草地早熟禾叶片萎蔫度呈上升趋势，污泥处理的萎蔫程度均显著低于对照组(P<0.05)，但全污泥与半污泥处理间差异不显著(P>0.05)。

图2 干旱胁迫下污泥对草地早熟禾萎蔫度影响Fig. 2 Wilting rate of Poa pratensis in response to biosolids during drought stress

FC,田间饱和持水量。不同小写字母表示同一干旱程度不同污泥处理间差异显著(P<0.05)。

FC，field capacity. Different lowercase letters indicate significant difference for the same drought stress among different biosolid treatments at the 0.05 level.

2.3 叶片相对含水量

充分浇水条件下，第1次取样时半污泥处理的草地早熟禾叶片相对含水量为90.89%(表3)，显著高于对照(P<0.05)，之后所有处理间相对含水量无显著差异(P>0.05)。随着干旱胁迫的进行，各处理叶片相对含水量逐渐下降，但污泥处理的叶片相对含水量始终高于对照组(表3)。半污泥处理在中度干旱(50%田间持水量)及重度干旱(35%田间持水量)时，叶片相对含水量与对照差异显著(P<0.05)，分别提高了12.3%及15.7%；全污泥处理的叶片相对含水量在重度干旱(35%田间持水量)较对照组显著上升了15.52%(P<0.05)。复水后，各处理的叶片相对含水量基本均恢复到正常状态，并无显著差异(P>0.05)。

2.4 可溶性糖含量

充分浇水条件下，各处理的叶片可溶性糖含量变化幅度较小(表4)，第1次取样时污泥处理显著提高了草坪草可溶性糖含量(P<0.05)，而后各处理间叶片可溶性糖含量无显著差异(P>0.05)。干旱条件下，各处理叶片可溶性糖含量均呈逐渐上升趋势，在极度干旱(25%田间持水量)时达到最高。全污泥处理的草地早熟禾叶片可溶性糖含量在前4个取样点均高于对照，且在试验开始时(90%田间持水量)与对照组差异显著(P<0.05)，但全污泥处理与半污泥处理间叶片可溶性糖含量无显著差异。复水7 d后各处理叶片可溶性糖含量均降低，基本恢复至试验初始水平。

2.5 丙二醛含量

正常浇水条件下，各处理的叶片丙二醛含量变化较平稳(表5)，7月2日全污泥处理的草地早熟禾叶片丙二醛含量显著高于半污泥处理(P<0.05)，其他取样点3个处理间的叶片丙二醛含量无显著差异(P>0.05)。干旱胁迫条件下，草地早熟禾叶片丙二醛含量呈现先上升后下降的趋势。全污泥处理在 7月9日(35% 田间持水量)时与半污泥差异显著(P<0.05)，但在7月20日(25% 田间持水量)半污泥处理丙二醛含量显著高于全污泥处理，约为其1.71倍(P<0.05)。

表3 草地早熟禾叶片中相对含水量变化Table 3 Changes of relative water content in Poa pratensis leaves %

表4 草地早熟禾中可溶性糖含量变化Table 4 Changes of soluble sugar content in Poa pratensis %

表5 草地早熟禾中丙二醛含量变化Table 5 Changes in malondialdehyde content in Poa pratensis nmol·mL-1

2.6 根重

正常浇水时，全污泥和半污泥处理的根重与对照相比均显著提高(P<0.05)，且污泥施用量与根重正相关(图3)。干旱条件下，施用污泥的草地早熟禾根重均高于对照，且半污泥处理的草坪草根重为0.77 g·kg-1，较对照显著提高了35.8%(P<0.05)(图3)。

2.7 抗氧化酶活性

2.7.1超氧化物歧化酶 充分浇水条件下，全污泥叶片SOD活性呈下降趋势，对照及半污泥处理叶片SOD活性均先升后降(表6)，7月27日全污泥和半污泥处理的草地早熟禾叶片SOD活性均显著高于对照(P<0.05)，均提高了约50%。干旱胁迫下，叶片SOD活性基本出现先上升后下降趋势，污泥处理中SOD活性在7月2日和7月20日出现了两次升高现象。试验开始时(90%田间持水量)污泥处理的草地早熟禾SOD活性明显低于对照(P<0.05)，但重度干旱(50% 田间持水量)时全污泥组SOD活性显著提高到197 U·g-1(P<0.05)，重度干旱(35% 田间持水量)时半污泥处理SOD活性则是对照的1.23倍，极度干旱(25% 田间持水量)时全污泥处理和半污泥处理的叶片SOD活性均显著高于对照组(P<0.05)。

图3 草地早熟禾根系的干重变化Fig. 3 Changes in root dry weight in Poa pratensis

不同小写字母表示同一水分处理不同污泥处理间差异显著(P<0.05)。

Different lowercase letters for the same moisture treatment indicate significant difference between different biosolid treatment at the 0.05 level.

2.7.2过氧化氢酶 正常浇水条件下，各处理叶片CAT活性变化幅度较小(表7)，除6月17日全污泥处理的叶片CAT活性显著低于其余两个处理外(P<0.05)，在其余取样点各处理间叶片CAT活性无明显差异(表7)。干旱胁迫下，所有处理的叶片CAT活性均呈现下降趋势，但污泥处理降低速率低于对照，极度干旱(25%田间持水量)时全污泥和半污泥处理叶片CAT活性分别为42和45 U·g-1，均显著高于对照(P<0.05)。复水7 d后所有处理的CAT活性均升高，但低于初始90%田间持水量水平。

2.7.3过氧化物酶 充分浇水条件下，半污泥处理的草地早熟禾叶片POD活性均高于对照，在7月20日叶片POD活性为354 U·g-1，与对照相比显著提高(P<0.05)。干旱条件下，草地早熟禾叶片POD活性呈先升高后下降的趋势(表8)。在试验开始时全污泥处理的叶片POD活性显著高于半污泥处理(P<0.05)，但在极度干旱(25%田间持水量)时，半污泥处理的叶片POD活性达到最高,为501 U·g-1，较对照显著上升了21%(P<0.05)。

2.7.4抗坏血酸过氧化物酶 充分浇水条件下，草地早熟禾叶片的APX活性基本均呈现升高趋势。在中间3次取样时，半污泥处理的草地早熟禾叶片APX活性都高于对照和污泥处理(表9)，且7月2日、7月9日半污泥处理的叶片APX活性为8.5和9.4 U·g-1，与全污泥处理相比显著提高(P<0.05)。干旱胁迫下，草地早熟禾叶片的APX升高，随干旱处理的进行，APX活性下降，试验后期叶片APX活性再次升高，7月20日(25%田间持水量)、7月27日(复水7 d)时全污泥处理的叶片APX活性高于对照，但差异不显著(P>0.05)。

表6 污泥对草地早熟禾SOD活性的影响Table 6 SOD activity of Poa pratensis plants in response to biosolids U·g-1

表7 污泥对草地早熟禾CAT活性的影响Table 7 CAT activity of Poa pratensis plants in response to biosolids U·g-1

表8 污泥对草地早熟禾POD活性的影响Table 8 POD activity of Poa pratensis plants in response to biosolids U·g-1

表9 污泥对草地早熟禾APX活性的影响Table 9 APX activity of Poa pratensis plants in response to biosolids U·g-1

3 讨论

3.1 生物污泥能改善草地早熟禾的生长状态

当前有关污泥对绿地植物抗性影响的研究较少，但已有研究表明，污泥的施用可以提高草坪草的抗旱性[10]。在污泥对高羊茅水分胁迫的影响研究中，干旱胁迫下污泥处理后的坪观质量、叶片相对含水量均高于未施用污泥的高羊茅，并且污泥处理后叶片萎蔫程度明显降低，表明污泥增强了高羊茅抗旱性[22]。研究结果显示，在两种浇水条件下，与对照相比，全污泥和半污泥均能显著提高草地早熟禾的坪观质量并降低其叶片萎蔫度，表明生物污泥可以改善草地早熟禾的生长状态，进而提高其耐旱性。

3.2 生物污泥可促进草地早熟禾的渗透调节及根系生长

本研究结果显示，与对照相比，两种水分条件下，半污泥处理能显著促进根系生长，全污泥处理可显著提高可溶性糖含量。同时在充分浇水条件下，半污泥处理的草地早熟禾可溶性糖含量显著升高，全污泥处理后草地早熟禾根重明显增加了56.4%。污泥中存在生长素的含量为0.5～2.4 μg·g-1，生长素含量上升会导致干旱条件下草坪草根系生物量显著增加[22]。研究表明，在一定范围内增加污泥用量可以促进黑麦草可溶性糖含量升高[23]。添加污泥作为基质可以显著提高多年生黑麦草叶片丙二醛含量，而高羊茅丙二醛含量在污泥基质处理与无污泥对照之间无显著差异，说明一定量的污泥对黑麦草有一定的伤害作用，且对不同草坪草的影响不同[14,24]。本研究表明，施用污泥可以提高草地早熟禾的根系生物量和渗透调节能力。

3.3 生物污泥能提高草地早熟禾的抗氧化酶活性

绿地植物主要依靠抗氧化防御系统来保护细胞消除干旱诱导的氧化伤害。植物体内抗氧化防御机制中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶及抗坏血酸过氧化物酶活性增加，可以降低细胞损伤[12,25]。大量研究发现，适量污泥可以提高草坪草的抗氧化酶活性，增强清除活性氧能力，显著提高其抗性[6,14,21,23,26-27]。但污泥中含有Cu、Zn等重金属和有毒病原物质，当施用污泥增加时，重金属含量积累升高，会对植物的新陈代谢、酶活性等起到抑制作用[15-16]。本研究表明，充分浇水条件下，全污泥和半污泥处理的叶片超氧化物歧化酶活性在试验后期均显著增加，半污泥处理的草地早熟禾叶片过氧化物酶活性也比对照明显上升。极度干旱(25%田间持水量)时，施用全污泥和半污泥的草地早熟禾叶片超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性均显著升高，且半污泥处理的草地早熟禾过氧化物酶活性显著提高至对照的1.3倍，施用污泥可以提高草地早熟禾抗氧化酶活性，有效降低细胞受损，进而提高其耐旱性。这与前人研究结果基本一致，但污泥的施用量不同导致结果略有差异，有关污泥含量与促进细胞抗氧化能力间的关系需进一步研究探讨。

4 结论

生物污泥中存在促进植物生长的营养物质，干旱条件下施用污泥能提高草地早熟禾的坪观质量及渗透调节能力，促进根系生长，污泥作为基质还可以提高草地早熟禾的抗氧化酶活性，增强草地早熟禾的抗旱能力。干旱条件下，半污泥处理的草地早熟禾根重显著高于不添加污泥的对照组，但全污泥处理的叶片可溶性糖含量明显比无污泥的对照高，表明不同污泥用量对草地早熟禾耐旱性的影响存在差异。目前污泥增强草地早熟禾的抗性机理尚未明确，后期可以从基因角度探究污泥对草坪草抗逆机理。