修剪对土壤Pb形态及高羊茅Pb含量的影响

薛博晗，李 娜，宋桂龙，李诗刚，濮阳雪华，李金波

(1.北京林业大学草坪研究所，北京 100083； 2.深圳市铁汉生态环境股份有限公司，广东 深圳 518040)

近年来，随着重工业、采矿业和电子制造业的快速发展及废弃物的违规排放，导致大量重金属铅(Pb)进入土壤、水体以及生态系统。Pb污染土壤不仅对人类健康和生态造成危害，在经济方面也存在巨大的复垦和修复费用问题，是全球重视的环境问题[1]。这些年植物提取已经成为一种替代传统修复工程的技术，具有经济高效、环境扰动小、二次污染小等优点[2]。

有研究表明，对植物地上部分进行修剪或刈割，不仅能提高植物地上部分的再生能力，还能促进植物对重金属的吸收，提高植物修复效率[3]。刘颖茹等[4]研究表明，多次刈割，不同砷浓度处理的蜈蚣草(Eremochloaciliaris)生物量差异逐渐缩小，但并没有降低砷的积累速度，即适当刈割能提高蜈蚣草对砷的富集效率。傅大放和温丽[5]研究发现，刈割能够促进黑麦草(Loliumperenne)对Pb的吸收和累积。

Pb在土壤和植物吸收中的溶解度和迁移率取决于其化学形态[6]。能够被植物根系吸收利用的土壤重金属形态称为重金属有效态，具有生物有效性，一般以离子态、酸溶态等为主[7]。酸溶态易于从土壤中解析，被植物根系吸收，重金属有效性和生物毒性最高，可还原态在土壤酸度增加时发生转化，表现出较高的有效性。修剪(刈割)一定程度上可以刺激根系碳水化合物的分泌，即根系分泌物，影响土壤的理化性质[8]。张微微等[9]研究发现，刈割处理下驼绒藜(Krascheninnikoviaceratoides)根际土壤微生物群落发生变化、土壤酶活性增加，有利于土壤理化性质的改善。pH是影响土壤中重金属有效态和植物吸收的最主要的因素[10]。研究发现，通过对重金属污染土壤中施加酸性改良剂能够降低根际土壤pH，提高土壤中重金属可交换态、弱酸溶解态等具有活性的重金属形态的含量[11-13]。当下修剪对植物富集能力的影响研究主要集中在植物对重金属的积累量，关于修剪改善土壤理化性质影响植物对重金属吸收的研究鲜有报道。

高羊茅(Festucaelata)作为常见的冷季型草坪草，具有环境适应性强，生物量大，耐修剪，对重金属有一定的耐受能力和富集能力等优点，是目前植物修复技术的重要研究材料。有研究发现，高羊茅对Cd、Pb、Cu等重金属有一定的富集潜力[14-15]，且相比于常见草坪草植物剪股颖(Agrostismatsumurae)、紫羊茅(F.rubra)等，具有较强的耐受性[16-17]。本研究通过研究Pb胁迫下，不同修剪次数处理对高羊茅根际土壤pH、土壤Pb不同形态含量及转化情况、高羊茅根系及地上部分Pb含量的影响，从土壤重金属形态变化角度分析探讨修剪对高羊茅Pb含量的影响，为高羊茅在Pb污染土壤修复的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试验地概况

供试的植物材料为高羊茅(品种k31)，试验于2016年7-9月在北林科技温室进行。试验用土取自北京林业大学草坪研究所昌平试验基地试验田0-20 cm土层土壤，黄壤土，全氮含量为0.81 mg·kg-1，有效磷含量为30.70 mg·kg-1，速效钾含量为105.30 mg·kg-1，pH 7.47，Pb含量为1.61 mg·kg-1。

1.2 试验设计

试验采用完全随机设计，Pb胁迫浓度设置4个水平，为0、500、1 000、1 500 mg·kg-1。修剪处理设置4个频次水平，为不修剪、1次/15 d(9月5日)、2次/15 d(9月5日、9月12日)、5次/15 d(9月5日、9月8日、9月11日、9月14日、9月17日)。每个处理4次重复。

采用土培盆栽方式，选用高为25 cm，长、宽均为15 cm的长方体黑色花盆，每盆装土5.3 kg，将Pb(CH3COO)2·3H2O固体粉末配成相应浓度溶液一次性施入，浇自来水(无Pb元素检出)，控制田间持水量在60%左右，自然静置2周。

使用蛭石∶草炭=2∶1的基质育苗，出苗7 d后选取长势一致的高羊茅幼苗，洗去根部基质残留移栽至静置2周的花盆中，每盆40株，在试验盆中恢复1周后每盆定株30株。培养期间定期浇水，控制田间持水量在60%左右。修剪处理在定株15 d后(2016年9月5日)进行，修剪留茬高度为6 cm[18]，修剪试验时间为15 d。

1.3 测定指标与方法

1.3.1土壤pH 试验最后收获时，取高羊茅根际土壤风干，过1 mm筛，称取10 g风干土于50 mL锥形瓶中，加入无CO2的蒸馏水，土水比为1∶2.5，间歇摇动30 min，放置30 min后用酸度计测定pH[19]。

1.3.2土壤Pb形态含量 采用BCR连续提取分析法测定土壤中重金属各形态含量，BCR分析法将土壤重金属形态分为4种，即酸溶态、可还原态、可氧化态、残渣态，依据章海波等[20]的提取方法对土壤Pb各形态进行提取，按提取液加入顺序不同提取不同形态的Pb：(1)0.11 mol·L-1的醋酸(HOAc)提取酸溶态Pb，包括弱酸可溶态和可交换态Pb;(2)0.5 mol·L-1盐酸羟胺(NH2OH·HCl)+2 mol·L-1硝酸(HNO30)提取可还原态Pb，包括铁/锰氧化物结合态；(3)30%双氧水(H2O2)+1 mol·L-1醋酸铵(NH4OAc)( pH 2.0)提取可氧化态Pb，包括有机物和硫化物结合态；(4)第三步提取液过滤残渣表示残渣态。各提取态采用HNO3∶HClO4=4∶1消解，并用原子吸收分光光度计(Varian Spectrum AA220)火焰吸收法测定Pb含量。

土壤Pb形态含量计算公式为Pb含量=(C1-C2)·V/m，其中C1表示样液的浓度(g·mL-1)；C2表示空白液的浓度(g·mL-1)；V表示样液定容体积(mL)；m表示为消煮样品质量(g)。

1.3.3生物量 将每次修剪后收获的地上部分用自来水及蒸馏水反复冲洗3次，于105 ℃杀青15 min，80 ℃烘干至恒重[21]。最后收获时，将所有试验处理的高羊茅材料分为地上修剪部分、留茬部分及根系3部分，并用自来水和蒸馏水分别洗净，杀青并烘干至恒重。将每种修剪处理的地上修剪部分合并称重为地上修剪部分的生物量，留茬部分及根系干重即为其生物量。

1.3.4Pb含量 植物样品采用HNO3∶HCLO4=4∶1湿法消解。采用原子吸收分光光度计(Varian Spectrum AA220)火焰吸收法测定Pb含量[21]。含量计算方法与土壤Pb形态含量计算方法相同。

转运系数=地上部分Pb含量/根系Pb含量。

1.3.5成熟叶片及根尖超微结构观测 选取修剪试验结束后的新鲜叶片和根，并用锋利的小刀切取叶片和根若干份，迅速放置于2.5%戊二醛固定液中。叶片选取留茬部分的第3片真叶，切取3 mm×1 mm小段，根选取根尖往上2～3 cm处，切取1 mm小段。将放入固定液中的样品材料抽真空，使材料完全浸入固定液中。参考钟海涛[22]的处理方法进行样品的固定-脱水-渗透-包埋-切片。采用日立HT7700透射电镜对成熟叶片及根尖的细胞及亚细胞结构观测。

1.4 数据分析

使用Microsoft Excel 2016软件整理原始数据，采用SPSS 20.0对土壤pH、土壤Pb不同形态含量、高羊茅各部分生物量、Pb含量进行单因素方差分析，并将Pb含量与土壤各形态指标做相关性分析。单因素方差分析采用Duncan法对数据进行多重比较(P<0.05)。相关性分析采用Pearson相关系数来表示相关性(双尾)。绘制图表采用Origin Pro 2015。

2 结果与分析

2.1 修剪高羊茅对Pb胁迫下土壤pH的影响

同一Pb浓度处理下，根际土壤pH随修剪次数的增加呈降低的趋势，表现为5次<2次<1次<不修剪(表1)。不同Pb处理，5次修剪的土壤pH显著小于不修剪和1次修剪处理(P<0.05)，而1次和2次修剪的pH差异不显著(P>0.05)。同一修剪处理，随着Pb胁迫浓度增加，根际土壤的pH呈现下降趋势。结果表明，修剪处理降低土壤pH，在Pb胁迫下，土壤pH随修剪次数的增加下降趋势更加明显。

表1 Pb胁迫不同修剪次数下土壤pH变化Table 1 Effect of different cutting times on soil pH under Pb stress

同列不同小写字母表示不同修剪次数处理间差异显著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters within the same colume indicate significant differences in treatment between different cutting times at the 0.05 level; similarly for the following tables and figures.

2.2 修剪高羊茅对Pb胁迫下土壤Pb不同形态含量影响

修剪高羊茅处理下，土壤中Pb各形态含量的变化情况如图1所示，Pb胁迫下，随着修剪次数的增加，土壤中Pb的酸溶态及可还原态含量呈现显著上升趋势(P<0.05)，表现为5次>2次>1次>不修剪；Pb的可氧化态含量呈现显著下降趋势(P<0.05)。

Pb胁迫下，5次修剪的Pb的酸溶态和可还原态含量显著大于1次修剪和不修剪(P<0.05)。Pb胁迫浓度为 0、500、1 000、1 500 mg·kg-1时，5次修剪的Pb的酸溶态含量分别为不修剪的1.64、1.51、1.32和1.18倍，可还原态含量分别为不修剪的1.43、1.48、1.17和1.15倍。无Pb胁迫时，土壤中Pb酸溶态随修剪次数增加而增加，而2次修剪、1次修剪和不修剪处理的Pb可还原态含量差异不显著(P>0.05)。Pb胁迫浓度为500 mg·kg-1时，5次修剪处理的Pb酸溶态和可还原态含量显著大于其他修剪处理(P<0.05)，且1次修剪和2次修剪含量无显著性差异(P>0.05)。Pb胁迫浓度为1 000 mg·kg-1时，5次修剪处理Pb的酸溶态和可还原态含量显著大于2次修剪、1次修剪和不修剪处理(P<0.05)。Pb胁迫浓度为1 500 mg·kg-1时，Pb的酸溶态和可还原态含量变化趋势相同，2次修剪和5次修剪显著大于1次修剪和不修剪处理(P<0.05)。

图1 Pb胁迫下修剪处理对土壤中各形态Pb的含量变化的影响Fig. 1 Effect of cutting on the changes of soil morphological contents under Pb stress

5次修剪处理的Pb的可氧化态含量显著小于其他处理(P<0.05)，Pb胁迫浓度为 0、500、1 000、1 500 mg·kg-1时，5次修剪的可氧化态含量分别为不修剪的91.4%、61.6%、73.0%、72.2%(图1)。Pb胁迫浓度为1 000 mg·kg-1时，2次和5次修剪处理的Pb可氧化态含量差异不显著(P>0.05)；Pb胁迫浓度为1 500 mg·kg-1时，5次修剪的可氧化态含量显著小于2次(P<0.05)。可以看出，修剪次数的增加降低了土壤中Pb可氧化态含量，且随着Pb胁迫浓度增加，土壤中Pb的可氧化态含量的降低趋势更加明显。

2.3 修剪对Pb胁迫下高羊茅生长的影响

相同Pb胁迫浓度下，高羊茅地上修剪部分、留茬部分及根系生物量随修剪次数的增加而呈现下降趋势，表现为5次<2次<1次<不修剪，且存在显著差异(P<0.05)(表2)。无Pb胁迫时，5次修剪的修剪部分及留茬生物量显著小于不修剪(P<0.05)，而2次与5次的差异不显著(P>0.05)。Pb胁迫浓度为500、1 000 mg·kg-1时，5次修剪的修剪部分及留茬生物量显著小于不修剪及1次修剪(P<0.05)。Pb胁迫浓度为1 500 mg·kg-1时，5次修剪的修剪部分生物量显著小于1次修剪和不修剪，留茬部分生物量显著小于不修剪，而1次、2次与5次的差异不显著(P<0.05)。相比于不修剪处理，5次修剪高羊茅修剪部分生物量分别下降了17.6%、17.4%、50.0%和50.5%，留茬部分生物量分别下降了35.6%、49.6%、51.2%和52.9%。

相比于修剪部分及留茬部分生物量积累情况，修剪处理对根系生物量积累的影响最大。5次修剪的根系生物量显著小于1次和不修剪处理(P<0.05)(表2)。不同Pb浓度胁迫下，相比于不修剪处理，5次修剪根系生物量分别下降了51.1%、64.8%、67.0%、59.4%。相比于1次修剪，5次修剪的生物量分别下降46.2%、55.0%、56.6%、55.6%。由此可以看出，Pb胁迫下，修剪处理会抑制高羊茅地上部分及根系生物量的积累，其中对根系生物量的影响最大，5次修剪下降幅度达50%以上。

2.4 修剪对Pb胁迫下高羊茅Pb含量的影响

Pb胁迫下不同修剪处理对高羊茅地上修剪部分、留茬及根系Pb含量变化影响情况如图2所示。留茬及根系Pb含量随修剪次数的增加呈上升趋势，表现为5次>2次>1次>不修剪，且差异显著(P<0.05)；修剪部分Pb含量呈现相反趋势，随修剪次数增加而降低且差异显著(P<0.05)。留茬部分Pb含量均在5次修剪时达到最大值且与其他修剪处理达到差异显著(P<0.05)；不修剪和1次修剪留茬部分Pb含量差异不显著(P>0.05)。Pb胁迫浓度为500、1 000、1 500 mg·kg-1时，相比于1次修剪，5次修剪的留茬部分Pb含量分别提高了41.4%、53.4%、45.4%；相比于2次修剪，5次修剪的留茬部分Pb含量分别提高了24.2%、12.9%、21.9%。数据表明，修剪次数的增加更有利于留茬部分Pb的吸收和转运。

不同处理下，高羊茅根系Pb含量最大值均在5次修剪时出现，分别为285.20、1 588.34、2 015.56、3 302.78 mg·kg-1(图2)。不同Pb胁迫下，5次修剪根系Pb含量显著大于其他修剪处理(P<0.05)，且相对于不修剪处理，根系Pb含量分别提高了143.1%、104%、56.7%、60.1%；相比1次修剪，5次修剪的Pb含量分别提高了66.6%、69.4%、41.3%、45.9%；相比于2次修剪，5次修剪的Pb含量分别提高了26.5%、46.8%、19.6%、16.4%。说明随着修剪次数的增加，促进了高羊茅根系对Pb的吸收。

2.5 高羊茅成熟叶片及根尖细胞超微结构

修剪促进了高羊茅根系对Pb的吸收和向地上部分的转运，选取Pb 1 000 mg·kg-1胁迫+不修剪处理、Pb1 000 mg·kg-1胁迫+2次修剪处理的留茬成熟叶片及根尖进行超微结构观测。留茬成熟叶片的亚细胞结构观测显示(图3)，Pb胁迫时只有部分叶绿体膨胀为椭圆形，叶绿体基质内质体小球的数量大幅度增加。相同浓度Pb 1 000 mg·kg-1胁迫+2次修剪处理，大部分叶绿体膨胀为圆形或椭圆形，类囊膜结构更加不清晰、受损或破裂，质体小球数量显著性增加。

高羊茅根尖分生区细胞的超微结构观测显示(图4)，Pb 1 000 mg·kg-1胁迫下，大量超微结构改变，细胞壁上出现大量重金属晶体及电子致密颗粒，细胞核有膨胀现。Pb 1 000 mg·kg-1胁迫+2次修剪处理下，核膜出现破损，核仁数量大量增加，液泡及细胞壁上重金属大量聚集。

表2 Pb胁迫下修剪处理对高羊茅生物量积累的影响Table 2 Effects of cutting on biomass of tall fescue under Pb stress g·pot-1

图2 Pb胁迫下修剪处理对高羊茅各部分Pb含量的影响Fig. 2 Pb content in tall fescue by different cutting treatment under Pb stress

CW,细胞壁；CH,叶绿体； Pb,质体小球；M,重金属沉积。对比Pb胁迫，Pb胁迫+修剪下，叶绿体膨胀，质体小球数量增加，类囊体膜结构排列不清晰，细胞壁出现大量重金属Pb沉积。

CW, cell wall; CH, chloroplast; Pb, plastid pellet; M, heavy metal deposition. Compared with Pb stress, under the treatment of Pb stress+cutting, chloroplast expansion, the number of plastid pellets increased, the thylakoid membrane structure was not clear, and there was a lot of heavy metal Pb deposition on cell wall.

2.6 高羊茅各部分Pb含量与土壤Pb不同形态的相关性分析

对Pb胁迫的修剪处理下，高羊茅各部分Pb含量与土壤pH、土壤Pb形态含量进行相关性分析(表3)。土壤pH与土壤Pb酸溶态及Pb可还原态呈现极显著负相关(P<0.01)，与土壤Pb可氧化态呈现极显著正相关，说明土壤酸度的增加有利于土壤中Pb形态向Pb酸溶态及可还原态的转化。高羊茅留茬部分及根系Pb含量与土壤Pb酸溶态和可还原态均呈现极显著正相关，与土壤Pb可氧化态呈现极显著负相关。说明土壤中Pb酸溶态含量及Pb可还原态含量的增加有利于高羊茅对土壤中Pb的吸收。

N,细胞核；CW,细胞壁；M,重金属沉积; Vac,液泡；PS,质壁分离。对比Pb胁迫，Pb胁迫+2次修剪时大量Pb沉积在细胞壁与液泡，形成致密电子层，并出现质壁分离现象。

N, nucleus; CW, cell wall; M, heavy metal deposition; Vas, vacuole; PS, plasmolysis. Compared with Pb stress, under the treatment of Pb stress + cutting, a large number of Pb were deposited on the cell walls and vacuoles to form a dense electron layer, and the phenomenon of plasmolysis was appear.

N1,修剪部分Pb含量；N2,留茬部分Pb含量；N3,根系Pb含量；N4,土壤Pb酸溶态；N5,土壤Pb可还原态；N6,土壤Pb可氧化态；N7,土壤pH。

N1, the Pb content of cutting part; N2, the Pb content of stubble; N3, the Pb content of root; N4, the acid-extractable of Pb; N5, the reducible state of Pb; N6, the oxidizable state of Pb; N7, soil pH.

3 讨论

3.1 修剪植物对土壤重金属Pb形态的影响

植物对重金属的吸收取决于土壤中重金属的有效性。土壤溶液作为植物可利用重金属和植物养分供给池，土壤的化学成分及性质是影响重金属生物有效性的关键因素，包括土壤pH、有机质、根系分泌物等[23]。土壤pH不仅代表容易确定的土壤特征，也是易于管理的土壤参数[24]。有研究发现Pb的生物有效性和植物吸收可以通过降低土壤pH来实现[24]。根据BCR连续提取法中对重金属的生物可利用性的定义，土壤中重金属的酸溶态及可还原态含量越高，重金属生物活性越大[25]。Begonia等[26]观察到随着土壤pH的降低，根系Pb积累量增加。本研究中，有Pb胁迫时，随着修剪次数的增加，土壤pH有明显下降的趋势，土壤中Pb的酸溶态、可还原态含量呈现增加趋势，且5次修剪下显著增加，而可氧化态含量显著下降(P<0.05)，根系Pb含量也有明显增加。修剪处理降低了高羊茅根际土壤pH，增加了土壤中有效态Pb含量，促进植物对Pb的吸收。这可能是修剪下植物体内可溶性糖的再分配变化影响根系分泌物的变化，并且存在对土壤中微生物活动及土壤酶的影响，改善土壤理化性质，进而影响土壤Pb形态变化，因此进一步研究修剪处理下根系分泌物、微生物数量、群落特征及土壤酶活性并且探讨有Pb胁迫和无Pb胁迫对土壤微环境变化的影响是有必要的。

3.2 修剪植物对植物重金属Pb含量的影响

刈割(修剪)会引起植物根际土壤水分、养分、土壤酶活性及土壤微生物数量等根际微环境的变化[9]。一方面修剪会影响植物地上/地下部分光合产物的分配量，这不仅影响根系的生长，也会影响根系分泌物的量，根际微生物的量及活性，进而影响到土壤理化性质；另一方面修剪会改变植物对土壤营养元素的需求量，进而影响土壤根际微环境。修剪通过影响土壤根际微环境，促进土壤重金属向有效态的转化，增加植物对重金属的吸收。本研究中，修剪处理促进了高羊茅对土壤Pb的吸收，并且修剪次数的增加提高了根系对Pb的吸收及向地上部分的转运，这与孙宁骁和宋桂龙[27]、刘颖茹等[4]的研究结果一致。根系及地上留茬部分Pb含量随修剪次数的增加呈现显著递增趋势，而修剪部分Pb含量呈下降趋势，这可能是由于修剪处理产生的补偿生长效应[28]，促进根系大量吸收水分及无机盐，此过程中，Pb元素与矿质养分的吸收竞争[29]，刺激了根系对Pb的大量吸收，且促进了Pb向地上的转运，但由于频繁修剪使转运到留茬部分的Pb不能及时转运到修剪部分，从而大量的Pb积累在地上留茬部分。

3.3 修剪植物对细胞超微结构的影响

叶绿体是植物进行光合作用的主要场所，而叶绿体的膜系统尤其类囊膜结构是植物吸收光能并且进行转化的必要前提，但叶绿体对重金属毒害作用较为敏感[30]。本研究发现，Pb胁迫下，高羊茅成熟叶片中叶绿体发生了明显的变化，且修剪处理下，有叶绿体膨胀，类囊膜结构受损，质体小球数量增加等一系列亚细胞结构损伤现象。有研究发现，低浓度重金属胁迫下，叶绿体形态无明显变化；而高浓度的重金属胁迫下，叶绿体膨胀成圆形或椭圆形，类囊体膜结构排列松散不清晰，甚至受损、破裂[31]。叶绿体基质中的质体小球是重金属胁迫下叶绿体类囊膜结构降解及膜脂过氧化，降解物脂质聚集的产物[32]。本研究中Pb 1 000 mg·kg-1胁迫下高羊茅叶片叶绿体中质体小球数量明显增加，而Pb 1 000 mg·kg-1胁迫+2次修剪处理下，质体小球数量增加更明显，从而也说明了叶绿体膜结构的破损及裂解。Najeeb等[29]的研究发现，Pb胁迫下的湿地植物灯芯草(Juncuseffusus)根尖分生组织细胞中，细胞变大，随胁迫增加，细胞核膨胀，核膜被破坏，细胞核不清晰，核仁数量增加等一系列超微结构的变化，与本研究中根尖细胞中细胞核的变化情况一致，且修剪处理下，根尖细胞壁富集大量重金属致密电子颗粒。从超微结构进一步说明，修剪处理能促进高羊茅根系及地上部分对Pb的吸收。关于修剪处理下高羊茅根系Pb向地上部分转运机制及途径，修剪后地上部分主要集中部位等需要进一步研究。

4 结论

本研究表明，随着修剪次数的增加，高羊茅根际土壤pH降低，土壤酸环境增强，土壤Pb酸溶态升高、可还原态含量增大，土壤Pb可氧化态含量降低，土壤中Pb的有效性增强，有利于根系对Pb的吸收。修剪处理下，高羊茅修剪部分、留茬及根系生物量随修剪次数的增加而降低，但是修剪可以促进高羊茅对Pb的吸收和积累，且留茬部分及根系Pb含量随着修剪次数的增加而增加，转运到地上的Pb主要积累在留茬部分。Pb浓度为 500、1 000、1 500 mg·kg-1时，5次修剪的留茬部分Pb积累量比例占地上总积累量的60%左右。高羊茅成熟叶片和根尖超微结构观测结果显示，Pb胁迫+修剪处理，细胞伤害加重，重金属沉积增加。高羊茅各部分Pb含量与土壤Pb各形态含量显著相关(P<0.05)。修剪对提高高羊茅Pb的吸收和转运有积极的作用，但是会影响植物生物量，尤其是根系生物量，因此，合适的修剪次数及方法就显得尤为重要。