椰心叶甲高毒力绿僵菌菌株筛选及分子鉴定

李 亚，黄贝芳，陈月银，高 新，陈龙通，李锦鸿

（广东海洋大学农学院，广东 湛江 524008）

椰心叶甲Brontispa longissima（Gesto）是热带地区的一种重要害虫，主要为害棕榈科经济植物，如椰子Cocos nucifera、大王棕Roystonea regia、酒瓶椰子Hyophorbe lagenicaulis、槟榔Areca catechu、老人葵Washingtonia fi lifera、蒲葵Livistona chinensis、棕榈Trachycarpus fortunei和鱼尾葵Caryota ochlandra等，其中椰子是最主要的寄主植物［1-3］。由于椰心叶甲寄生性广泛且破坏性强，我国在1992年将椰心叶甲列为植物检疫二类危害性害虫［4］，其幼虫及成虫均群栖潜藏于卷折的心叶内，沿箭叶叶轴纵向啮食最幼嫩的心叶的表皮薄壁组织，在叶上留下与叶脉平行、褐色至深褐色的狭长条纹，严重时可造成树势衰败甚至整个植株死亡，严重制约了棕榈科经济作物和苗木培育产业的发展［5］。目前对椰心叶甲的防控多以化学农药防治为主，即对叶面进行喷药防治，尽管使用化学农药可取得较快的效果，但长期依赖化学农药防治椰心叶甲，容易引起抗药性问题，农药大量使用既造成严重的环境污染，又给人们的健康构成极大威胁［6］。因此，开发低毒、高效、无残留、无公害和易生产的生物农药用来控制椰心叶甲的发生是当前迫切需要的。

绿僵菌Metarhiziumspp.是一类广谱性昆虫病原真菌，由于其寄生物种多、致病力强、适应性强、致病周期短、靶标性强、对人类和牲畜不会造成毒害以及环境友好的特点，目前在森林、农作物以及公共卫生害虫防控方面都进行了应用效果的评估［7-8］，如利用绿僵菌生防制剂成功防控华北大黑鳃金龟［9］、樟巢螟［8］、黄曲条跳甲［10］、二斑叶螨［11］等害虫，但目前利用该菌防控椰心叶甲的报道较少。本研究对受害椰心叶甲中具有高毒力的绿僵菌菌株进行筛选和分子生物学鉴定，以期获得高毒力绿僵菌菌株，旨在提供优良菌株用于开发防治棕榈科植物虫害的菌剂，为椰心叶甲的生物防控提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

SDAY培养基：酵母浸出粉10 g，葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，琼脂20 g，加蒸馏水至1 000 mL；PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂1.7%，加蒸馏水至1 000 mL；PPDA培养基：在PDA 培养基中加入1%的蛋白胨。

供试虫源采自海南省海口市椰子树上，在室温下用新鲜椰子心叶饲养1个月，待种群稳定后选取各虫态的健康虫体进行试验。进行试验时取健康虫体放入养虫盒中,并用新鲜椰子心叶饲养、备试，饲养温度为 26～ 28℃ , 湿度为 70%～ 80%；经人工饲养后分别挑选健康的、大小一致的成虫和龄期相同的幼虫进行试验。参照周荣等［3］的方法，依据体长和头壳宽度，将幼虫分为2～3龄幼虫（体长2.62～5.09 mm，头宽0.53～0.91 mm）、四龄幼虫（体长5.89～6.19 mm，头宽1.15～1.19 mm）和五龄幼虫（体长7.61～7.85 mm，头宽1.30～ 1.32 mm）。

1.2 椰心叶甲僵虫来源及绿僵菌菌株分离纯化

椰心叶甲僵虫采集地为发生椰心叶甲疫情严重的海南省各地，于2012—2016年从野外虫害发生严重地区采集自然感染虫生真菌的椰心叶甲僵虫并带回实验室。

将椰心叶甲僵虫用70%乙醇消毒1 min，然后在0.1%氯化汞溶液中浸泡1 min，倒去氯化汞溶液后用无菌水冲洗；再挑取少许僵虫组织接种于SDAY培养基（分别加入终浓度为50 μg/mL的氯霉素和100 μg/mL的放线菌酮）平板上，将平板放置于28 ℃恒温培养箱中培养，待虫体长出菌落，从这些菌落中挑取少量菌丝体制片观察，进行初步鉴定。从鉴定为疑似绿僵菌的菌落边缘挑取菌丝块转接于PDA培养基平板继续培养观察，待培养至产生分生孢子时，取少量分生孢子粉用0.05% Tween 80溶液配成低浓度的孢子悬浮液，再用划线培养法进行纯化。分别对纯化的供试菌株进行编号，其中HK1201、HK1202、HK1304菌株采自海南省海口市；LD1301、LD1302、LD1206菌株采自海南省乐东县；DZ1307、DZ1401、DZ1403菌株采自海南省儋州市；DF1301、DF1303菌株采自海南省东方市；CM1501、CM1502、CM1601菌株采自海南省澄迈县；WC1504、WC1603菌株采自海南省文昌市。

1.3 椰心叶甲高毒力绿僵菌菌株的筛选

将上述纯化的菌株接种于PPDA培养基上，26℃下恒温培养10 d，刮取孢子置于组织研磨器用含0.05% Tween 80的无菌水配制成浓度为1.0×108孢子/mL的悬浮液。取健康新鲜的椰子心叶，洗净晾干后分别用上述纯化的菌株的分生孢子悬浮液喷洒于椰子心叶上面至叶片湿润，晾干叶片后将其放入消毒养虫盒中，把选出的供试椰心叶甲成虫和四龄幼虫分别接至叶片上饲养，同时放置棉球保持湿度；对照为以喷洒0.05%的Tween 80灭菌水的椰子心叶饲养。试验设椰心叶甲成虫和四龄幼虫以及对照3个处理，每个处理3次重复，每个重复试虫20头。处理后每天观察1次，记录死亡虫数，连续观察15 d，记录椰心叶甲死亡数量，计算死亡百分率。在观察和记录死亡虫数时，将死虫体拣出，置于预先放有若干湿棉球的无菌培养皿中进行保湿培养，待虫体上长出白色菌丝体和绿色孢子层时，挑取少量菌丝体制片，镜检观察以确定虫体上长出的菌是所接种的菌株。

1.4 高毒力绿僵菌菌株对椰心叶甲的致病力

选取上述试验中对椰心叶甲毒力较好的绿僵菌菌株，用含0.05% Tween 80的无菌水分别配制成含5.0×108、2.5×108、1.0×108、7.5×107、5.0×107孢子/mL的悬浮液，分别用上述试验方法对供试椰心叶甲四龄幼虫和成虫进行处理，对照用0.05% Tween 80无菌水处理供试椰心叶甲。根据各处理供试昆虫的死虫数，采用SPSS 11.0软件对其进行分析。绿僵菌对椰心叶甲的LT50计算根据线性回归法进行，其他数据的差异显著性用ANOVA方差分析［12］。

1.5 高毒力绿僵菌菌株分子生物学鉴定

将上述试验中筛选到的高毒力绿僵菌菌株在PDA培养基上培养至产孢，分别收集孢子提取DNA作为PCR模板，依照Curran等［13］方法设计引物5’-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3’和5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3’，应用PCR扩增绿僵菌ITS序列，扩增的PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果进行Blast比对分析，利用MEGA4和ClustalX 1.8构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 对椰心叶甲具有高毒力的绿僵菌菌株筛选

以浓度1.0×108孢子/mL悬浮液喷洒椰子心叶饲养的椰心叶甲成虫和四龄幼虫，供试的16株绿僵菌菌株对椰心叶甲成虫和四龄幼虫致病力的测定结果见表1。从表1可以看出，供试菌株HK1304和CM1601对椰心叶甲的致病性较好，接菌后10 d椰心叶甲成虫和四龄幼虫死亡率均达到100%，其中CM1601菌株对成虫和四龄幼虫的LT50分别为4.1、3.9 d，HK1304菌株对成虫和四龄幼虫的LT50分别为4.4、4.2 d，因此取菌株CM1601和HK1304作为椰心叶甲高毒力株进行下一步试验。

表1 不同分离株菌对椰心叶甲成虫和四龄幼虫的致病力

2.2 菌株CM1601和HK1304对椰心叶甲的致病力

用菌株CM1601和HK1304分别配制成5.0×107、7.5×107、1.0×108、2.5×108、5.0×108孢子/mL的孢子悬浮液喷洒叶片后测定对椰心叶甲的致病力，结果见图l。从图1可以看出，椰心叶甲四龄幼虫和成虫的累计死亡率随着菌株CM1601或HK1304孢子浓度的增加而上升。菌株CM1601在孢子浓度为1.0×108、2.5×108、5.0×108孢子/mL时对椰心叶甲四龄幼虫和成虫致病力没有显著差异，但与浓度为5.0×107、7.5×107孢子/mL时有显著差异（P=0.0387）；而菌株HK1304在孢子浓度为2.5×108孢子/mL、5.0×108孢子/mL时对椰心叶甲致病力没有显著差异，但与浓度为 5.0×107、7.5×107、1.0×108孢子/mL时有显著差异（P=0.0274）。

2.3 菌株CM1601和HK1304的分子鉴定

对菌株CM1601和HK1304的rDNA-ITS序列测序结果进行Blast比对分析，结果（图2）表明，菌株CM1601的rDNA-ITS序列（GenBank 收录号：MH547100）与金龟子绿僵菌M. anisopliae的该序列相似性达100%，菌株HK1304的rDNA-ITS序列（GenBank 收录号：MH547101）与金龟子绿僵菌蝗变种M. anisopliae var. acridum的该序列相似性达100%。将测得两菌株的rDNA-ITS序列与Genbank中已有的其他种株该序列一起应用Neighbor-joining法构建系统进化树，结果表明菌株CM1601与金龟子绿僵菌聚在一起成为一个分支，菌株HK1304和金龟子绿僵菌蝗变种聚在一起成为分支。

图1 菌株CM1601和HK1304对椰心叶甲的致病力

3 结论与讨论

野外采集椰心叶甲僵虫是分离绿僵菌的第一步，选择合适的采集地点和合理的采集时间是能否成功分离到绿僵菌的关键因素，通常需要选择椰心叶甲为害严重的地方及温湿度适宜的时间采集，这样受绿僵菌感染死亡的虫体出现的几率相对较大［14］。本研究采集椰心叶甲僵虫的地点主要选择海口、儋州、乐东、东方、澄迈和文昌等椰心叶甲为害严重的地区，选择采集僵虫的时间是雨后2～3 d，因为雨后环境湿度的增加，有利于自然环境中的绿僵菌感染椰心叶甲，也有利于感染的僵虫体上长出菌丝体后易于判断。本研究挑选长出菌丝体的椰心叶甲僵虫分离绿僵菌，结果从采集的僵虫中分离到16株不同地理来源的疑似绿僵菌菌株。

图2 基于菌株CM1601和HK1304的rDNA-ITS序列构建的进化树

昆虫病原真菌是昆虫病原微生物中最大的类群之一，是有害昆虫生物控制的潜力生物资源，而其对有害昆虫致病力强弱是衡量昆虫病原真菌生防潜力的重要指标［15］。本研究测定16株疑似绿僵菌菌株对椰心叶甲成虫和四龄幼虫的致病力，结果发现1.0×108/mL孢子/mL浓度处理不同菌株对椰心叶甲的毒力差异较大，其对成虫和四龄幼虫的累计死亡率范围分别为70.29%～98.18%和73.25%～100%。从中筛选得到2株高致病力菌株CM1601和HK1304。用不同浓度的孢子对椰心叶甲进行详细的毒力测定，结果显示，椰心叶甲四龄幼虫和成虫的累计死亡率随着菌株孢子浓度的增加而上升，但当CM1601菌株浓度上升到1.0×108孢子/mL或HK1304菌株浓度上升到2.5×108孢子/mL，菌株对椰心叶甲的致病力达到峰值，再增加孢子浓度不会增加其致病力，表明如果菌株CM1601和HK1304作为生防菌用于防治椰心叶甲，其喷洒叶片的最适孢子浓度分别为1.0×108孢子/mL和2.5×108孢子/mL。椰心叶甲1龄幼虫虫体很小，发育历期短，且喷菌后自然死亡率很高，所以本试验剔除了1 龄幼虫；2～3龄幼虫在喷菌后还会继续蜕皮，而幼虫的蜕皮对虫生真菌感染幼虫有一定的抵御作用，因此用2～3龄幼虫测定绿僵菌毒力与实践中有较大误差；4～5龄幼虫对绿僵菌具有较好的敏感性，作为绿僵菌毒力测试的试验虫体较为合适；此外，成虫是评价绿僵菌毒力强弱的指标之一［16-17］。因此，本研究选用4幼虫和成虫成为绿僵菌毒力试验的测试虫体，用于评价不同菌株对椰心叶甲致病力强弱。

Weiland等［18］利用分子生物学方法对绿僵菌属真菌分类进行了系统研究，测定了100 余株绿僵菌属菌株的ITS序列，发现用该序列进行比对和系统发育树分析可以作为绿僵菌属菌株分类的可靠依据。例如，申剑飞等［19］通过对绿僵菌属菌株的ITS1-5.8S、rRNA-ITS2 区域进行序列克隆和比对分析，分别鉴定了平沙绿僵菌M.pingshaense和贵州绿僵菌M. guizhouense。本研究通过对绿僵菌ITS序列和建立的系统发育树的分析，鉴定菌株CM1601和HK1304分别为金龟子绿僵菌和金龟子绿僵菌蝗变种。筛选出2株毒力较高的绿僵菌属菌株CM1601和HK1304在毒力试验中与其他菌株相比较有明显的差异性，但在野外防治椰心叶甲的潜力如何，还有待进一步的大田试验来验证。

利用绿僵菌生防制剂作为生物农药防控椰心叶甲是未来该害虫生物防治的发展方向，因此分离鉴定对椰心叶甲成虫和幼虫具有高致病力的绿僵菌菌株具有重要的价值和较大的应用潜能。本研究在椰心叶甲为害严重的地区及温湿度适宜的时间采集椰心叶甲僵虫，从长出菌丝体的僵虫上分离到绿僵菌16株疑似绿僵菌。用椰心叶甲成虫和4龄幼虫作为试验对象对上述分离的疑似绿僵菌菌株进行致病力测定，发现用浓度1.0×108孢子/mL的悬浮液喷洒椰心叶甲取食的椰子心叶后均能对椰心叶甲致病，其中菌株CM1601和HK1304对椰心叶甲成虫和4龄幼虫致病力最高，其LT50均在4.5 d以下，表明其对椰心叶甲具有高毒力，可以作为昆虫病原真菌在实际生产中防控椰心叶甲。进一步用菌株CM1601和HK1304分别配制成梯度浓度的孢子悬浮液喷洒叶片后测定对椰心叶甲的致病力，表明椰心叶甲的累计死亡率随着孢子浓度的增加而上升，菌株CM1601和HK1304作为生防菌用于防治椰心叶甲最佳浓度为1.0×108、2.5×108孢子/mL。通过ITS序列测定及系统进化树分析，鉴定菌株CM1601和HK1304分别为金龟子绿僵菌和金龟子绿僵菌蝗变种。本研究分离的金龟子绿僵菌CM1601和金龟子绿僵菌蝗变种HK1304均对椰心叶甲成虫和幼虫具有较强的致病力，是具有潜在应用价值的优良菌株，在后续研究中还应进一步深入研究生态环境因子与绿僵菌毒力之间的关系，明确绿僵菌对椰心叶甲的致毒机理，为绿僵菌作为有害昆虫椰心叶甲生物控制的开发应用奠定基础。