桔梗种子发育过程中外观形态及生理生化的变化

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(中国农业科学院特产研究所， 吉林 长春 130112)

桔梗(Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.)属于桔梗科桔梗属多年生双子叶草本，是一种药、食、赏兼用植物[1]。紫花桔梗为桔梗科(Campanulaceae)桔梗属(Platycodon)唯一的种，而白花桔梗为其一个变种[2-3]。桔梗为一个广布种，具有广阔的开发应用前景。目前对桔梗种子的研究主要集中在种子休眠、萌发及贮藏等方面，对种子发育特点的相关研究较少。

注：A为紫花桔梗种子；B为白花桔梗种子。图1 桔梗种子发育过程中的形态变化

种子的发育过程是植物有机个体发育的最初阶段，该阶段是形成幼苗的必经之路，不仅影响种子本身的特性，同时也直接关系到下一代的正常生长发育[4-5]。桔梗果实成熟后开裂，种子易落地，加之种子很小，若种子采收过晚，因成熟大量脱落，造成巨大的损失；若采收过早，其风干后不饱满，影响种子的质量与品质。本实验以紫花桔梗和白花桔梗种子为材料，研究种子发育过程中的外观形态特点及生理生化变化，以确定种子的适宜收获期，为桔梗种子的发育生理研究及种子生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地点及样品采集

紫花桔梗和白花桔梗种子采自中国农业科学院特产研究所药用植物资源圃。于桔梗盛花期进行人工标记，种子取样时间为2016年8月至9月，每隔3 d采集1次种子，至果实成熟。获得3～61 DAF紫花桔梗种子和3～58 DAF白花桔梗种子(其中25～61 DAF紫花桔梗种子和25～58 DAF白花桔梗种子用于发芽率、生理生化等指标的测定)果实采收后密封待用。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 种子形态观测方法

通过目测和20倍解剖镜观测种子的外观形态。

1.2.2 发芽率测定

将不同发育时期的桔梗种子放入铺有2层滤纸的培养皿中，在25 ℃条件下光培养，每皿100粒，3次重复，统计发芽率。

1.2.3 种子含水量测定

称取不同发育时期的种子0.5 g，3次重复，于恒温(130℃±2℃)条件下烘4 h，测定种子的含水量。

1.2.4 相对电导率测定

参考张心慧[6]的方法，将30粒桔梗种子放入30 mL重蒸馏水中，在黑暗条件下，于25 ℃浸泡3 h，然后用DDS-11 A型电导率仪测定种子的电导率(A1)，随后沸水浴1 h，最后测定其煮沸后的电导率(A2)。

相对电导率(%)=A1/A2×100%。

1.2.5 脂质过氧化产物及各种抗氧化酶的测定

丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶( SOD) 活性、过氧化物酶( POD) 活性及过氧化氢酶( CAT) 活性的测定参照王学奎[7]的方法。

1.3 数据处理与分析

利用Excel 2010软件和DPS v 7.05统计分析软件进行数据处理、制图以及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 种子发育过程中的形态变化

桔梗种子发育过程中的外观形态变化明显(图1)。种子形状有细卵形、长卵形、卵形。3 DAF与7 DAF种子分别为无色和粉紫色；10～25 DAF种子颜色经历了由浅紫色向紫色的转变，在28 DAF开始变为酱紫色；22 DAF紫花桔梗和19 DAF白花桔梗种子的顶端(略宽一端)开始具明显的圆滑棱，共2～4支；31～46 DAF种子颜色经历了由酱紫色向深紫色的转变；52～61 DAF紫花桔梗与49～58 DAF白花桔梗种子颜色变化依次为深紫色、黄褐色(或褐色)、黑色(或黑褐色、乌黑色等颜色)；种翅的厚度随着发育进程逐渐变薄，其颜色也由浅变深，55 DAF紫花桔梗和52 DAF白花桔梗种子的种翅颜色开始由无色变为暗黄色或黄褐色，随后变为深褐色或黑色；61 DAF紫花桔梗和58 DAF白花桔梗种子表面具有与种子长轴平行的细长条纹理。说明白花桔梗种子的外观形态变化先于紫花桔梗种子。

2.2 种子发育过程中含水量与发芽率的变化

紫花桔梗与白花桔梗种子经历了自然脱水，且在不同发育阶段其脱水速率不同；其中34～46 DAF紫花桔梗种子与34～40 DAF、49～52 DAF白花桔梗种子含水量的下降速率明显高于其他发育阶段；至种子发育末期，紫花桔梗种子含水量下降了20.51%，白花桔梗种子含水量下降了15.70%(图2)。

图2 桔梗种子发育过程中含水量的变化

种子的发芽率随着发育进程呈上升的趋势。紫花桔梗和白花桔梗种子均在28 DAF具有发芽能力，发芽率分别为24.33%、26.00%(图3)，随后种子萌发率不断升高，最后分别达到72.33%、91.00%；其中34～37 DAF种子的发芽率明显增加，前者发芽率由34.00%增至48.67%，增加了14.67%，后者由37.00%增至61.00%，增加了24.00%。在整个发育过程中，紫花桔梗种子的萌发率低于白花桔梗种子，而其含水量的变化则相反。

2.3 种子发育过程中相对电导率的变化

紫花桔梗与白花桔梗种子的相对电导率随发育进程呈下降趋势(图4)，分别由58.35%下降至29.70%，57.33%下降至29.26%；其中34～37 DAF种子的相对电导率下降明显，分别由49.39%降至41.97%，43.73%降至40.58%，各下降了7.43%、3.15%。25～46 DAF白花桔梗种子的相对电导率明显低于同发育时期的紫花桔梗种子，但两者的下降速率几乎相同，分别以平均每天0.97%与0.98%的速率下降；在种子发育后期，两者的相对电导率差异不明显。这一结果表明，随着种子不断成熟，膜的选择透性逐渐增大，尤其是发育后期，种子细胞膜完整性趋于完善。

图3 桔梗种子发育过程中发芽率的变化

图4 桔梗种子发育过程中相对电导率的变化

2.4 种子发育过程中抗氧化酶活性的变化

2.4.1 过氧化氢酶(CAT)活性变化

在发育过程中，紫花桔梗与白花桔梗种子的CAT活性变化表现出“上升—下降”的趋势(图5)，25 DAF种子的CAT活性分别为19.41 U/mg、17.11 U/mg；随着种子不断发育，其CAT活性分别在55 DAF、43 DAF达到最高，各为45.15 U/mg、52.95 U/mg；此后两者的CAT活性分别快速下降为11.89 U/mg、11.52 U/mg。在紫花桔梗与白花桔梗种子的发育后期，其CAT活性变化较小。

2.4.2 过氧化物酶(POD)活性变化

紫花桔梗与白花桔梗种子POD活性与CAT活性的变化类似，都呈单峰曲线变化；25 DAF种子的POD活性分别为19.00 U/mg、19.80 U/mg；活性峰值分别在55 DAF、46 DAF，POD活性分别为33.71 U/mg、46.58 U/mg，此后种子的POD活性快速下降，分别降为5.00 U/mg、8.83 U/mg(图6)。发育后期的紫花桔梗与白花桔梗种子的POD活性变化较小。

图5 桔梗种子发育过程中CAT活性的变化

图6 桔梗种子发育过程中POD活性的变化

2.4.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性变化

在紫花桔梗与白花桔梗种子发育过程中，其SOD活性呈“上升—下降—上升”的变化趋势(图7)；25 DAF种子的SOD活性分别为3 775.37 U/g、3 061.98 U/g。紫花桔梗种子SOD活性在40 DAF达到最高，为4 876.76 U/g；40～46 DAF种子的SOD活性逐渐降低，随后又逐渐上升至4 407.35 U/g。白花桔梗种子在34 DAF上升至4 158.86 U/g，在40 DAF又快速下降至3 163.02 U/g，40～58 DAF种子的SOD活性不断升高，最后高达4 771.65 U/g。这表明白花桔梗种子SOD活性变化的时间先于紫花桔梗种子。在发育后期，紫花桔梗与白花桔梗种子的SOD活性变化均较小。

2.4.4 丙二醛(MDA)含量变化

紫花桔梗与白花桔梗种子的MDA含量随发育进程表现出“上升—下降”的变化趋势(图8)，25 DAF种子的MDA含量分别为17.98 nmol/mg、18.37 nmol/mg；随着种子不断发育，其MDA含量分别在52 DAF、46 DAF达到最大，各为48.22 nmol/mg、93.29 nmol/mg；随后快速下降，分别降低至5.32 nmol/mg、10.76 nmol/mg，即种子发育末期的MDA含量最低。

图7 桔梗种子发育过程中SOD活性的变化

图8 桔梗种子发育过程中MDA含量的变化

3 结论与讨论

种子产量的高低、品质的好坏与种子的收获期密切相关。研究认为种子形态指标、生理生化指标等都可被作为种子适宜采收期的判定指标[8]。有研究表明，大豆种子的含水量可作为其生理收获期的一个准确指标[8-9]；沙葱种子的颜色变为黑色时，可作为确定种子适宜采收期准确快捷的指标[8]。本项研究中，28 DAF种子开始具有萌发能力，且此时种子颜色开始转变为酱紫色。34～37 DAF种子的颜色经历了由酱紫色向深紫色的转变，其发芽率、含水量、相对电导率也相应地发生了明显变化。61 DAF紫花桔梗与58 DAF白花桔梗种子的颜色为黑色、乌黑色、黑褐色或深褐色，且种子表面出现与种子长轴平行的细长条纹理，此时种子含水量与相对电导率达到最低，发芽率达到最高，即此时的形态特征可作为桔梗种子适宜采收期的判定指标。

种子在脱水过程中会产生活性氧(AOS)[10]，而SOD、POD 和 CAT 是生命活动中具有协同作用的保护酶[11]，其不仅可以抵御AOS对细胞造成的伤害，还在种子发育过程中获得脱水耐性，对抵抗不良环境的影响等方面具有重要作用[12-13]。其中，SOD 主要的功能是催化超氧阴离子自由基发生歧化反应生成过氧化氢(H2O2)[14]；POD、CAT可消除H2O2的胁迫作用，有效保护膜结构[11,14-15]。本研究结果显示，种子发育过程中POD与CAT呈先升后降的变化，这与闫晓娜等[11]和颜世超等[16]的研究结果一致。种子的POD与CAT活性升高，有利于清除体内的氧自由基，保护细胞膜结构完整。在种子发育后期，SOD活性逐渐上升，POD与CAT活性却逐渐降至最低，可能是SOD在清除AOS过程中积累的H2O2抑制了POD与CAT的活性[11]。

MDA是膜脂过氧化的最终产物。本研究表明，在桔梗种子自然脱水过程中，MDA含量呈“上升-下降”的趋势，这与小麦[17]、沙葱[8]、玉米胚[18]种子脱水时MDA含量的变化类似。种子含水量下降会引起生物体内发生过氧化反应，导致MDA含量的增加；随着种子不断发育成熟，脂质过氧化作用降低，则MDA含量不断下降。

CAT、POD、MDA 3个指标均呈单峰曲线变化。三者在40～58 DAF紫花桔梗种子、34～55 DAF白花桔梗种子中发生了明显的变化，说明此阶段种子内生理代谢活动异常活跃，且白花桔梗种子内CAT、POD、MDA变化的时间先于紫花桔梗种子；此发育时期内种子的颜色经历了深紫色、黄褐色(或褐色)、黑色(或黑褐色、深褐色等颜色)的明显变化，种翅亦由无色变为暗黄色或黑褐色等颜色。

综上所述，种子在发育进程中，外观形态变化与生理生化变化有密切联系，且白花桔梗种子外观形态与生理生化变化的时间提前于紫花桔梗种子。种子发育后期的生理生化反应趋于稳定，且此时种子的发芽率逐渐增至最高。因此，建议紫花桔梗种子在61 DAF左右采收 ，白花桔梗种子在58 DAF左右采收。适宜时间采收的种子不仅有利于下一季播种，而且可为种质资源保存提供适宜的种子材料，延长种子的贮藏寿命，对于中药材生产实践及种质资源持续利用均具有重要的理论和现实意义。