谷红注射液抗脑缺血网络药理学分子机制研究

范芳芳，陈舒曼，杨洪军，张 艺，唐仕欢，李德风，张 毅，张晶晶，高金环

(1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；2.成都中医药大学民族医药学院，成都 611137)

脑卒中是严重影响人类生活健康的脑血管疾病，具有高致死、高致残率、高复发率等特性。《中国心血管病报告2016》推算，脑卒中现患病人数1 300万，占中国心血管病中病种人数比例首位[1]。其中以缺血性脑卒中为主，脑缺血是由于脑部血液供应障碍导致的脑血管疾病，脑缺血后血流恢复导致的脑组织损伤和功能障碍加重，即脑缺血性再灌注损伤。目前尚无根治脑缺血再灌注损伤的药物，但随着中西医结合思想的发展，中西药结合治疗脑血管疾病也取得较好的效果。

谷红注射液(Guhong injection,GH)是由乙酰谷酰胺与红花提取液组成的中西药联用复方制剂典型代表，主要用于增加脑保护、抵抗慢性缺氧、改善认知功能，但目前在减轻脑缺血损伤方面作用物质基础以及分子作用机制尚不明确[2-7]。本研究采用常用的大鼠大脑中动脉栓塞-再灌注模型，对谷红注射液治疗脑缺血再灌注损伤的药效作用进行考察；在有效性基础上，结合网络药理学技术，对其药效物质基础及分子作用机制进行网络预测，为谷红注射液进一步深入研究提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级健康SD大鼠30只，雄性，体重：280±10 g，由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供，合格证号：SCXK(京)2014-0004。饲养于中国中医科学院基础研究所动物实验中心，室温22～25℃，湿度55%，通风良好，自由进水饮食。将大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(Vehicle)、金纳多组(Ginaton)、谷中注射液低剂量组(GH-L)、谷红注射液高剂量组(GH-H)，每组6只。

1.2 试剂与仪器

谷红注射液(生产批号：20170402，通化谷红制药有限公司提供)；金纳多注射液(生产批号：KC068，中豪国际有限公司)；鱼线线栓购自北京西浓科技有限公司；戊巴比妥钠(merck：P11011)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-trephenyltetrazolium chloride，TTC，Lot# BCBR5462，)购自美国Sigma公司；4%多聚甲醛购自北京索来宝生物科技有限公司。

2 实验方法

2.1 模型建立

健康大鼠适应3天后，观察状态正常，开始造模，采用1%戊巴比妥钠腹腔注射(50 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，颈部剃毛消毒后固定于平板上，经颈正中切口，钝性分离皮下组织和肌肉，暴露出颈总动脉和颈外动脉。小心分离颈外动脉和颈内动脉，并用手术线将颈总动脉近心端和颈内动脉远心端结扎，阻断血流供应，颈外动脉近心端靠近动脉分叉处穿手术线打一松结，以防插线时切口处渗血，电凝器凝断远心端颈外动脉，用显微剪在颈外动脉剪一小口，插入直径为0.26 mm的线栓，缝合线稍扎紧后，松开颈内动脉上结扎线，将其缓慢插入颈内动脉，阻力明显时停止插栓，一般可插入长度18～20 mm后，松开颈总动脉近心端结扎线，观察无异常后，缝合伤口。90 min后根据情况再次麻醉大鼠，轻轻拔出线栓。假手术组操作步骤相同，不插入线栓。

2.2 给药

造模90min后拔栓即刻腹腔注射给药，24 h后再给药1次，Ginaton组给予Ginaton注射液0.8 mL·100 g-1，GH-L组给予谷中注射液0.062 5 mL·100 g-1，GH-H组给予谷红注射液高剂量0.25 mL·100 g-1,手术48小时后取材。

2.3 药效学评价指标

Longa 5分评分法：根据大鼠神经功能损伤不同该评分分6个等级：正常，无神经功能缺损，0分；左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损，1分；行走时，大鼠向瘫痪侧转圈，中度神经功能缺损，2分；行走时，大鼠身体向瘫痪侧倾倒，3分；重度神经功能缺损，不能自发行走，有意识丧失，4分；死亡，5分。分别对5个组别大鼠进行评分，记录。

TTC染色及脑梗死面积计算：1)大鼠称重后，1%戊巴比妥钠麻醉，断头取脑，生理盐水冲洗鼠脑，将脑放入脑模具内，依视交叉为基准，远心端切2片，近心端切4片，共切6片，每片2 mm，放入装有1% TTC染液的六孔板中，避光37 ℃下染色20 min，待颜色变成玫红色，回收TTC，加入4%多聚甲醛固定组织2 h，取出在白色背景下正反面拍照。2)脑梗死面积计算：应用Image J计算机图像分析软件统计脑片正反面白色梗死灶及整个脑片面积。以6片脑片正反白色梗死区域总面积与6片完整脑片正反总面积的百分比为脑梗死率计算，统计各组梗死率。

2.4 统计学处理

采用SPSS 21.0软件，进行实验数据的单因素方差分析，以P<0.05为显著性水平。

3 网络药理学分析方法

3.1 化学成分库建立

根据查阅文献[8-12]、TCMSP数据库(http://ibts.hkbu.edu. hk/LSP/tcmsp.php)、TCMIP数据库(http://www.tcmip.cn/)、TCMID(http://www. megabionet.org/tcmid/search/)数据库等平台搜集红花化学成分188个，由于乙酰谷酰胺为西药，且其主要是透过血脑屏障分解为γ-氨基丁酸和谷氨酸以发挥改善脑部功能作用，故乙酰谷酰胺按3个成分计。谷红注射液共收集得成分191个，均通过PubChem数据库搜集得其InChI结构，构建谷红注射液化学成分数据库。

3.2 靶点预测与功能富集

将所得谷红注射液成分InChI结构导入BATMAN-TCM数据库，以成分靶标预测评分≥15且P-value<0.05作为筛选指标进行谷红注射液靶标预测和作用通路等功能富集，下载相应的结果文件。

3.3 核心作用靶标与“成分-靶点-通路”网络构建

分别筛选出谷红注射液KEGG通路富集中P-value值小于0.05的通路，再经过文献查阅[13-18]筛选出与脑缺血再灌注损伤相关通路，找到谷红注射液作用通路12条，相关作用靶标748个。将共有靶标导入STRING数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl?UserId=E1Q8IT dPQFCh&sessionId=wby 686rpsVie&input_page_show_search=on)，构建潜在靶标的相互作用网络，靶标之间相互作用以可信度大于0.9构建蛋白相互作用关系，下载结果文档。根据BATMAN-TCM“成分-靶标”结果从中筛选可能作用于核心靶标的化学成分。最后应用Cytoscape软件构建“成分-靶点-通路”网络作用图，并应用Cytoscape中apps项下Centiscape2.2进行Degree、Betweeness、Closeness值进行分析，再根据apps项下MCODE进行核心网络分析，获取核心作用靶标。

图1 Longa 5神经学检查评分结果(与模型组相比，GH-H组与Ginaton组均具有显著性差异，P<0.05)Fig.1 Longa 5 neurological scores (Compared with the model group, there was significant difference in GH-H group and Ginaton group, P<0.05)

4 结果

4.1 Longa 5分评分结果

根据Longa 5分神经功能评分法结果，与Sham组相比，Vehicle组分值显著升高；与Vehicle组相比较，GH-L组、GH-H组与Ginaton组分值均降低，GH-H组与Ginaton组效果相近，见图1，表明谷红注射液与金纳多效果相当，都具有良好的改善脑缺血再灌注损伤作用。

4.2 TTC染色及脑梗死率结果

TTC染色结果显示(见图2a)，Sham组无白色梗死带，模型组与Sham组相比，可见明显的梗死面积；与模型组相比，GH给药组梗死面积相对减少，GH-H效果显著(P<0.05)，Ginaton梗死率较低，效果显著(P<0.05)；结合脑梗死面积率统计结果(见图2b)表明，谷红注射液对于脑缺血再灌注具有良好的保护作用。

与模型组相比，GH-H组与Ginaton组均具有显著性差异，P<0.05图2 TTC染色结果及梗死率结果Fig.2 The results of TTC staining and infarct rate

4.3 功能及通路富集分析

根据本研究建立的谷红注射液化学成分库，基于BATMAN-TCM平台分析，得到相应的药物靶标及功能通路分析结果。根据文献筛选出与脑缺血再灌注损伤相关功能通路[13-18]，筛选出谷红注射液通路12条，见下表1。可见谷红注射液主要通过以下Amino acid metabolism、Calcium signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、Lipid metabolism等通路发挥作用，从而改善脑缺血再灌注后损伤情况。

表1 红花、乙酰谷酰胺、谷红注射液共同通路Tab.1 The common pathways of safflower, acetylglutamine and Guhong injection

注：#表示为某一大类通路概念，故无相应的编号。

4.4 主要活性成分预测

基于BATMAN-TCM平台得到化学成分对应靶点，与共有靶点对比筛选得潜在作用成分131个，其中部分作用成分见下表2，主要有L-Lysin、L-glutamic acid、4-aminobutyric acid、Dotriacontanol、hydroxysafflor-yellow-A、safflomin-A等。

表2 部分主要活性成分Tab.2 Some of the main active ingredients

4.5 成分-靶点-通路网络构建

用Cytoscape 3.5.1软件构建谷红注射液抗脑缺血“成分-靶标-通路”网络作用图，得到图3，由网络图可知，谷红注射液有131个化学成分共同直接或间接作用于748个靶点，分别富集到氨基酸代谢、钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、氨酰-tRNA的生物合成、脂质代谢和其他氨基酸的代谢等通路，发挥相应的协同作用以改善脑缺血再灌注损伤。

图3 谷红注射液抗脑缺血成分-靶标-通路网络图Fig.3 The compound-target-pathway network diagram of Guhong injection against cerebral ischemia-reperfusion injury

4.6 核心靶标筛选及网络构建

基于STING数据库，将748个靶标导入数据库平台，靶点间连接置信度设置为0.9，建立靶点间的相互作用关系。根据Cytoscape中apps项下Centiscape 2.2和MCODE板块进行核心网络分析，根据其Degree、Betweeness、Closeness值综合评分(Score：35.302)，从大网络中提取获得的核心作用靶标64个，其网络见图4。根据节点Degree值大小可表明该节点在核心网络中的重要程度，可见网络中主要核心靶点有AGT、BDKRB2、NMUR2、IL8、AVP、CXCR4、AGTR1、CHRM2、EDN1、PF4和AGTR2等。其中最为核心的靶标是AGT(血管紧张素原)、BDKRB2(缓激肽B2受体抗体)、NMUR2(神经调节肽U受体2)、IL8(白介素-8)、AVP(血管加压素)和CXCR4(趋化因子受体)等。

图4 核心作用靶标图Fig.4 The key target network

5 讨论

谷红注射液为中西药联合用药，主要由乙酰谷酰胺和红花提取液组成，常用于治疗急性脑梗死、脑供血不足、脑血栓、脑出血和血管性认知障碍等脑血管疾病，具有较高的临床应用价值[11,19]。乙酰谷酰胺是谷氨酰胺乙酰化的衍生物，是中枢神经系统兴奋药，可透过血脑屏障后分解为γ-氨基丁酸和谷氨酸，继而发挥治疗脑功能、脑神经功能损伤作用。目前临床单用或是联合其他药物用于治疗脑缺血、脑功能衰退和脑血管后记忆力衰退和改善神经细胞代谢等脑部疾病[20]。红花提取液主要活性成分有红花黄色素、羟基红花黄色素、红花苷、黄酮类和酚酸类等，具有良好的活血化瘀功效，可减轻缺血性心脑血管损伤、抗氧化应激等作用[21-22]。二者联合使用，加强了其在治疗心脑血管疾病方面的共同作用，得到较好临床应用效果。本研究主要考察了谷红注射液干预脑缺血再灌注后大鼠脑梗死面积以及神经功能评分情况，结果发现，谷红注射液干预后可显著降低神经行为学评分，减轻大鼠脑梗死面积。进而采用网络药理学方法，构建“成分-靶点-通路”网络图，筛选出与脑缺血再灌注损伤相关化合物131个，相关作用靶标748个，共涉及12条作用通路。

其中，分析发现与脑缺血再灌注损伤相关化合物131个，主要包括L-赖氨酸，L-谷氨酸，γ-氨基丁酸，三十二烷醇，羟基红花黄色-A和红花素-A等活性成分。其中L-赖氨酸为人体必需氨基酸，其临床常用制剂盐酸赖氨酸注射液为脑病患者辅助药品，可治疗脑组织出血和缺氧性疾病[23]；红花黄色素A与羟基红花黄色素A可改善脑血流量，减轻脑梗死面积，并通过抑制兴奋性氨基酸产生的神经毒性、抗氧化应激、抗神经细胞凋亡和抑制炎症反应等作用达到抗脑缺血或缺血再灌注后大脑损伤[21-22]。

进一步对谷红注射液748个作用靶标网络特征分析，得到谷红注射液治疗脑缺血再灌注损伤核心网络靶标64个，核心节点主要有AGT、BDKRB2、NMUR2、IL-8、AVP、CXCR4、AGTR1、CHRM2、EDN1、PF4和AGTR2等。其中AGT(血管紧张素原)是脑内经典肾素-血管紧张素(RAS)通路的关键作用环节，能够生成一系列血管紧张素，如：血管紧张素-I (Ang I)、血管紧张素- II(Ang II)、血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]等，进而发挥血压调节、水电解质的平衡、保护脑缺血再灌注损伤等重要作用[24]；有研究报道，缺血性脑卒中患者相比正常人IL-8(白介素-8)mRNA表达增加，血浆中IL-8水平升高，表明其与脑缺血损伤有关，且随着病程的延长，IL-8水平升高加重脑损伤的程度[25-26]；EDN1(内皮素1)是具有血管收缩活性的一种活性多肽，对脑缺血过程中产生的氧化应激反应具有很好的调节作用[27]。

通过对作用靶标的功能富集分析发现，谷红注射液与红花、乙酰谷酰胺共同涉及12条作用通路，主要包括氨基酸代谢、钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、氨酰-tRNA的生物合成、脂质代谢和其他氨基酸的代谢等。其中氨基酸代谢、钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用等为脑缺血再灌注损伤过程中主要涉及作用通路，且各通路与通路之间相互关联、相互作用，如脑缺血后，细胞突触间隙堆积大量兴奋性氨基酸，包括氨基酸、天冬氨酸等，它们可激活谷氨酸AMPA和NMDA受体，进而引起Ca2+的大量内流，激活下游钙离子依赖性的死亡通路，引起神经细胞及胶质细胞发生坏死或者凋亡[28]，进一步加重脑缺血损伤。

综上所述，我们通过实验证明谷红注射液具有良好的脑缺血再灌注保护作用。进一步通过网络药理学分析表明，谷红注射液主要通过红花提取液中的羟基红花黄色素-A、红花素-A、L-赖氨酸和乙酰谷酰胺代谢产生的γ-氨基丁酸和L-谷氨酸等活性成分，调节BDKRB2、AGT、IL-8、EDN1、AVP等核心靶标，共同干预氨基酸代谢、钙信号通路和神经活性配体-受体相互作用等通路，以达到抗脑缺血再灌注损伤协同保护作用。但对于谷红注射液的主要活性成分及其作用机制还有待进一步的实验验证，以阐述其确切药效物质基础及作用机制。同时，本次研究为中西药联合使用类型制剂的合理性、实用性以及有效性提供了一定的科学研究思路与方法。