基于网络药理学的瓜蒌薤白半夏汤临床精准定位及药效成分研究

张 雯，吴宏伟，于现阔，范建伟，苏瑞强，郭非非，杨洪军

(1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700;2.成都中医药大学民族医药学院，成都 611137;3.鲁南制药集团股份有限公司中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006)

1 研究背景

瓜蒌薤白半夏汤出自东汉医家张仲景所著《金匮要略》，该方由瓜蒌、薤白、半夏和白酒组成，为治疗胸痹的经典名方。胸痹作为中医的证候描述，主要是由于正气虚亏，痰浊，瘀血，气滞，寒凝而引起心脉痹阻不畅，以胸部发生憋闷、气短，伴有心慌，严重者可出现胸部疼痛。临床上的诸多疾病均有胸痹的证候，例如冠心病、慢性充血性心力衰竭、缓慢性心律失常、病窦综合征、心脏神经官能症、心肌炎、早搏、心脏X综合征、急性冠状动脉综合征、反流性食管炎、慢性支气管炎等。其中以冠状动脉粥样硬化性心脏病(即冠心病)为胸痹的相关研究居多[1]。现代研究表明，瓜蒌薤白半夏汤有防治心血管疾病和调节血脂的作用，它能扩张冠状动脉、抑制血栓形成、抑制炎症反应、抑制心肌细胞凋亡和调节血脂[2-3]。

中医强调对症下药，即依据症状的精准用药。胸痹对应如此多的临床疾病，确定瓜蒌薤白半夏汤的临床精准定位对于临床使用该药物具有重要意义。此外，针对于包括瓜蒌薤白半夏汤在内的诸多经典名方开发，临床疾病的明确对于药物的开发及临床用药的指导是不可或缺的。

本文以瓜蒌薤白半夏汤为例，基于网络药理学的分析方法，确定瓜蒌薤白半夏汤两个主要的作用器官——心脏和肝脏，将其可能最有效的临床病症定位于急性的心脏疾病(例如心梗等)。此外，采用数据挖掘与先验知识相结合，预测瓜蒌薤白半夏汤可能作用的心率、心肌细胞死亡、免疫炎症、血管、脂质代谢等五个病理环节，并挖掘其对应的潜在药效成分。

2 研究方法

图1 技术路线Fig.1 Technical flow chart

本研究主要分为以下几个部分：1)基于ADMET化学成分的筛选能够有效预测药物的特性，实现类药成分的快速筛选；2)基于相似性的药物靶标预测，实现对于类药成分的靶标快速确认；3)药物潜在靶标的功能富集分析，挖掘药物可能作用的通路和生物学过程以及可能治疗的疾病类型；4)关键病理过程的关联成分挖掘，用以锁定潜在的药效成分。技术路线见图1。

2.1 瓜蒌薤白半夏汤化学成分的收集及筛选

通过文献调研及TCMSP(http://tcmspnw.com)、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)等中药成分数据库收集瓜蒌薤白半夏汤的化学成分。在此基础上，基于各化学成分的ADMET性质筛选其中具有较好类药性的成分用以后续计算分析。类药性是指与良好的临床疗效相关的药物的物理化学性质(如溶解性、稳定性等)。其中化合物的ADMET预测可以快速描述药物在生物体内的吸收、分布、代谢与排泄过程和毒性反应的特征，用于后续的类药筛选。中药复方中包含大量成分，能在人体内发挥药效作用的成分必须同时具备足够优秀的药理活性和类药性质[4]，剔除类药性较差的化合物，发现更多可能的药效成分，以便进一步的分析。

本文利用FAF-Drugs4数据库[5](http://fafdrugs3.mti.univ-paris-diderot.fr/)对瓜蒌薤白半夏汤的化学成分进行筛选[6]，预测其ADMET特性，随后基于表1的类药性质参数，筛选理化性质接近上市药物的化学成分。

表1 类药性质参数Tab.1 Main Parameters

2.2 基于药物-靶标相似性的瓜蒌薤白半夏汤的药物靶点预测

本文基于BATMAN-TCM对于类药化合物的靶标进行预测[10]。BATMAN-TCM所使用的靶标预测方法是基于相似性来预测中药组成化合物的潜在靶标的。它的核心思想是由Perlman等人首次提出的，实质是通过与已知的药物靶标的相互作用比较来计算相似性，并对潜在的药物靶标相互作用进行排序[11]。本文将筛选后的类药化学成分分别以全方、瓜蒌、半夏、薤白四种组合导入BATMAN-TCM数据库进行靶点预测，获得与瓜蒌薤白半夏汤化学成分可能发生相互作用的靶标蛋白，并选择其中高可信度(打分值大于20)的蛋白作为药物的候选靶点[12]。

2.3 药物潜在靶点功能富集分析

靶标分析功能基于功能条目的富集分析，用以考察该方的潜在靶标可能具有的生物学功能及参与的生物学通路。功能分析中涉及的GO功能条目，KEGG生物学通路，疾病条目以及组织特异性相关的分析均使用DAVID工具完成[13-14]。富集分析是基于超几何分布设计的算法，而针对富集分析显著性P-value的多重检验校正则使用的Benjamini-Hochberg校正方法。具体来说，本文将预测得到的药物潜在靶点导入DAVID数据库进行疾病富集，得到瓜蒌薤白半夏汤可能的主治病症。对全方、瓜蒌、半夏、薤白分别进行组织分布富集，再对富集到组织心脏和肝脏的靶点进行GO功能和KEGG通路富集。

2.4 “化合物成分-靶点-通路/功能”网络构建

根据前期文献挖掘得到的中药-成分关系，BATMAN-TCM平台的成分-靶点关系、DAVID数据库的靶点-功能通路关系，建立数据文件，利用Cytoscape 3.5.1软件绘制“成分-靶点-通路-功能”网络图。

3 结果

3.1 瓜蒌薤白半夏汤的类药成分及潜在靶标

根据数据库和文献挖掘的结果，得到瓜蒌薤白半夏汤780个化学成分。其中瓜蒌352个成分，包括氨基酸类17个，黄酮及酚类25个，挥发油、油脂和有机酸类185个，生物碱及含氮类29个，糖类9个，萜类45个，植物甾醇29个，其他成分32个；半夏有261个成分，包括氨基酸类22个，苯丙素类25个，环肽类6个，挥发油、油脂和有机酸类188个，生物碱及含氮类14个，甾醇类6个，其他成分12个；薤白有成分167个，含氮化合物9个，挥发油及脂肪酸类55个，甾体皂苷87个，其他成分17个。利用FAF-Drugs4数据库筛选后得到成分294个，其中瓜蒌137个，半夏114个，薤白43个。筛选前后的物理性质分布对比见图2。根据BATMAN-TCM数据库的预测结果，得到全方靶点710个，瓜蒌靶点654个，薤白靶点99个，半夏靶点587个

图2 成分理化性质筛选前后分布情况Fig.2 Physical-chemical characters before and after secection

Term条目CountPValueLiver肝1604.20e-18Heart心501.10e-07Skeletal muscle骨骼肌432.03e-05Hippocampus海马359.62e-05Brain cortex大脑皮层152.08e-04

3.2 瓜蒌薤白半夏汤的临床精准定位

3.2.1 潜在靶标的组织特异性

为了考察瓜蒌薤白半夏汤的主要作用器官，本文将全方靶点导入DAVID数据库，进行组织分布富集，富集结果显示全方作用的靶点大量富集到肝脏和心脏(见表2)，胸痹病位在心，与肝也有密切关系，基本病机为肝心失调[15]，后续分析将重点关注富集到肝脏和心脏的靶点。

3.2.2 心脏相关靶标的疾病富集结果

为了确认瓜蒌薤白半夏汤的可能作用的疾病，本文使用DAVID对全方靶点进行了疾病富集分析，富集到大量与心梗相关疾病的疾病条目(表3)，如心肌梗塞、心血管疾病、冠状动脉心脏疾病等。

表3 全方心梗相关疾病富集结果(P-Value≤0.01)Tab.3 Full-close result(P-Value≤0.01)

3.2.3 瓜蒌薤白半夏汤的潜在靶向的通路

对于富集到肝脏和心脏的靶点再次导入DAVID数据库，分别进行功能和通路富集，得到瓜蒌薤白半夏汤作用于心脏和肝脏的功能和通路(见表4)，可知全方对于心脏的作用可能集中于调节心率、扩张血管，以及心肌细胞存活、免疫炎症的调控等，而在肝脏发挥的作用可能集中于脂质代谢方面。

表4 全方在肝脏和心脏部位的功能通路(PValue≤0.05)Tab.4 Functional path of full-close on liver and heart

3.2.4 瓜蒌薤白半夏汤临床定位的确定

基于以上结果，我们初步认为，瓜蒌薤白半夏汤的临床应用主要是以心肌梗塞为主的心血管疾病。心肌梗塞是指由于各种原因引起的心血管中血液流通的异常，冠状动脉阻塞，导致心脏供血不足而心肌坏死，严重者发展为心肌梗死有极高的致死率[16]。国内每年有超过300万的心肌梗塞患者，且该数字正日益增长[17]，故瓜蒌薤白半夏汤治疗心肌梗塞的作用机理和药效物质基础研究尤为重要。基于富集分析的结果，瓜蒌薤白半夏汤可能通过调控心率，影响免疫炎症、心肌细胞的死亡、血管的功能以及调控脂质代谢等方面发挥作用。

4 瓜蒌薤白半夏汤潜在药效物质的筛选

根据上述功能/通路富集结果，将瓜蒌薤白半夏汤影响的生物过程分为心率、心肌细胞死亡、免疫炎症、血管、脂质代谢5类，为了能够进一步挖掘这5类生理过程与瓜蒌薤白半夏汤类药成分之间的关联，本文构建“药物-成分-靶标-通路”图用以描述。(2，3，4，5，6)。

4.1 心率调节相关的潜在药效成分

由图3可知，富集得到的心率相关通路有通过心脏传导调节心率(regulation of heart rate by cardiacconduction)和钙离子信号通路。研究表明钙超载可以使心肌部分去极化，引起缺血性心律失常，并且钙离子电流任何微小的变化即可导致其他离子电流改变，造成心肌电活动异常，调节钙信号通路，抑制钙超载可以明显减小心梗后心律失常的发生率[18]。邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate)是三味药共有的成分，均可能参与心率相关通路的调节。有研究证明邻苯二甲酸二丁酯具有引起血管收缩作用，初步机制可能涉及细胞膜电压门控性钙通道及钙离子内流[19]。degree值较高的化学成分有异亮氨酸(isoleucine)和亮氨酸(leucine)等，氨基酸对心血管功能有保护作用，不仅可减轻心肌在缺血再灌注、心力衰竭和心肌梗塞中的损伤，而且对血压、血脂和心律失常也有一定的调节作用[20]。

图3 心率相关“药物-成分-靶标-通路”Fig.3 Heart-rate related medicine-component-target-path

图4 心肌细胞死亡相关“药物-成分-靶标-通路”Fig.4 Cardiomyocyte medicine-comconet-target-path

4.2 心肌细胞死亡相关的潜在药效成分

图4中富集得到的心肌细胞死亡相关通路有MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)，该通路调节多种细胞活动，包括增殖，分化，存活和死亡[21]。degree值较高的化学成分有对香豆酸(p-coumaric acid)，毕思玲[22]发现川芎嗪对香豆酸能抑制缺血损伤大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(PC12)细胞凋亡，陈智[23]等人研究证明了对香豆酸组合物对急性髓系白血病(AML)细胞的增殖抑制作用，故对香豆酸能否调节心肌细胞死亡有待进一步研究。

4.3 炎症应答相关的潜在药效成分

图5富集得到的功能有负调控急性炎症反应，全身或局部的炎症反应，可能在急性心肌梗死的发生、发展和心血管事件中起重要作用[24]。

图5 免疫炎症相关“药物-成分-靶标-通路”Fig.5 Immunity related medicine-componet target-path

4.4 血管相关的潜在药效成分

图6富集得到的与血管相关的通路有PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)和血管平滑肌收缩(Vascular smooth muscle contraction)。高飞[25]等人通过研究证明了PPAR-γ激动剂能抑制血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞的表型转化，可以推测PPAR信号通路可能与血管平滑肌有关，从而参与心肌梗塞的病理过程，陈兰玉[26]基于PPAR信号通路探讨桑杞清眩颗粒对高血压心肌纤维化作用机制的研究，得出PPARα和PPARγ通过对炎性因子的开关效应影响了心肌重构的结论。甲基丁香酚(methyl eugenol)来自半夏，Lahlou S[27]等发现它可以引起小鼠低血压，可能是直接作用于血管平滑肌而扩张血管。

图6 血管相关“药物-成分-靶标-通路”Fig.6 Blood vessel related medicine-componet target-path

4.5 脂质代谢相关的潜在药效成分

图7富集得到了脂质分解代谢过程的负调控和脂肪酸代谢等与脂质代谢有关的功能和通路。

图7 脂质代谢相关“药物-成分-靶标-通路”Fig.7 Lipid metabolism related medicine-component-target-path

5 讨论

瓜蒌薤白半夏汤为中医药经典名方，功效行气解郁，通阳散结，祛痰宽胸，主治胸痹，现代研究表明该方有较好的防治心血管疾病和调节血脂的作用，其正丁醇部位、水溶性部位、和药渣水煎液部位能保护缺血缺氧损伤的心肌细胞[28]。本研究收集得到瓜蒌化学成分352个，半夏261个，薤白167个，通过类药性成分筛选，靶点预测，临床疾病定位，组织分布和功能通路富集，发现瓜蒌薤白半夏汤作用的部位在心脏和肝脏，对应的现代病症可能是以心肌梗塞为主的心血管疾病，其作用机制可能有：通过心脏传导调节心率和钙信号通路等与调节心率有关的过程，心肌细胞死亡相关的MAPK信号通路，负调控急性炎症反应，PPAR信号通路和血管平滑肌收缩等与调节血管平滑肌有关的过程，以及脂质分解代谢过程的负调控和脂肪酸代谢等脂质代谢相关过程，并进一步得到了107个可能作用于以上各生物过程的化学成分，比如三味药共有的成分邻苯二甲酸二丁酯，能调节钙离子内流影响心率，来自半夏的甲基丁香酚，可能作用于血管平滑肌而扩张血管。通过网络药理学分析瓜蒌薤白半夏汤的临床应用及药效成分，后续将进行其相应的实验验证研究，进一步明确其作用物质基础及分子作用机制。