粉防己碱激活Akt/GSK-3b信号通路保护心肌I/R大鼠研究

张克清，戴珍，李彦萍

安阳市中医院心内科，河南 安阳 455000

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是导致人类死亡的主要原因之一。据统计，全球每年超过2000万人死于冠心病，其中近一半死于急性心肌梗死(Acutemyocardial infarction，AMI)或心源性猝死[1]。AMI最有效的治疗手段为及时疏通病变血管以恢复心肌组织的血流灌注，但随之引发的心肌缺血/再灌注损伤(Ischemia/Reperfusion injury，I/R)成为临床治疗该病的难题，心肌I/R可导致心肌梗死面积进一步扩大，对远期预后造成很大影响[2]。蛋白激酶B/糖原合酶激酶-3b(Protein kinase B/Glycogen synthase kinase-3b，Akt/GSK-3b)通路是机体中重要的信号转导通路，广泛参与细胞的增殖、存活、凋亡等生物学过程。研究发现，Akt磷酸化后可从胞膜上脱离，进入胞质与胞核中，调节GSK-3b、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、p70S6蛋白激酶(p70S6K)等的表达，进而发挥心肌保护功能[3～4]。粉防己碱是从中药粉防己根部提取的生物碱，属于双苄基异喹啉衍生物。有关研究证实，粉防己碱具有抵抗心肌I/R的作用，但不清楚其具体保护机制[5]。故本研究通过建立心肌I/R大鼠模型，探究粉防己碱对I/R大鼠心肌梗塞面积、心脏功能及Akt/GSK-3b通路的影响，以期为AMI的治疗寻求新的手段。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠180只，体质量250～280 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXR(京)2015-0011。

1.2 实验药品 粉防己碱，分析标准品，纯度≥98%，购自上海源叶生物科技有限公司。辛伐他汀胶囊(理舒达)，规格：20mg，批准文号：国药准字H20030103，购自远大医药(中国)有限公司。

1.3 试剂与仪器 水合氯醛(上海化学试剂公司)；肌钙蛋白T(Cardiac troponin T，cTnT)、肌酸激酶同工酶(Creatine kinase MB，CK-MB)、乳酸盐脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(北京中生北控生物科技有限公司)；氯化硝基四氮唑蓝(Nitro Blue Tetrazolium Chloride，NBT)(上海前进试剂厂)；组织蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；一抗兔抗鼠Akt、pAkt单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；一抗兔抗鼠GSK-3b、pGSK-3b多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG溶液、超敏ECL化学发光试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)；TKR-200C小动物呼吸机(江苏省特力麻醉呼吸设备公司)；COBAS-FARAⅡ全自动生化分析仪(瑞士Roche公司)；MICROM-HM340E病理组织切片机(德国Microm公司)；DY89-Ⅰ电动玻璃匀浆机(宁波新芝科器研究所)；GE VividⅠ彩色多普勒超声便携机(GEHealthcare公司)。

1.4 分组与给药处理 大鼠适应性饲养1周后，随机分为6组，包括假手术组、模型组、辛伐他汀组(阳性药组)以及粉防己碱低、中、高剂量组，每组30只。辛伐他汀组于造模前14天给予辛伐他汀2.0mg/(kg·d)，连续灌胃14天；粉防己碱低、中、高剂量组于造模前20min分别一次性腹腔注射给予粉防己碱1.5mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg；假手术组与模型组于造模前20min一次性腹腔注射给予等体积生理盐水。

1.5 动物模型制备 参考邓宇珺等[6]方法建立心肌I/R大鼠模型。术前禁食不禁水12 h，用10%水合氯醛(0.3mL/100 g)腹腔麻醉大鼠，仰卧固定。检测并记录Ⅱ导联心电图，颈、胸部备皮消毒，钝性分离颈部皮肤暴露气管，切开气管后立即行气管插管，连接小动物呼吸机，条件设置95%O2、5%CO2、中等湿度的混合气体以80次/min频率进行通气；于3～4肋间钝性开胸暴露心脏，于左心耳与肺动脉圆锥左侧交界下方2～3mm处穿6/0号缝合线，进针深1.5～2 mm、宽2～3 mm，并用“U形管”以压管法活结结扎左冠脉前降支，肉眼可见心脏左室壁变暗变紫，同时心电图显示ST段明显抬高(＞0.25mV)代表结扎成功。心肌缺血30min后，再灌注24 h，可见缺血区逐渐变红，心电图ST段降至0.15mV左右代表再灌注成功。假手术组仅穿线不结扎。

1.6 血清cTnT含量及CK-MB、LDH活性测定 再灌注24 h后，于大鼠腹部主动脉采血，4℃、3 000 r/min离心10min，取上清液，分装后于-80℃冰箱保存备用。采用ELISA试剂盒检测血清cTnT含量，操作步骤严格按照试剂盒说明书；采用全自动生化分析仪测定血清CK-MB、LDH活性。

1.7 NBT染色法测定心肌梗死面积 采血后，剖胸取出大鼠心脏，用生理盐水洗去心腔残余血液，除去非心肌组织如脂肪、血管等，沿冠状沟将心房切除，称量左心室湿重。沿房室沟方向将左心室横切至4～5片，浸入NBT磷酸缓冲液中，37℃恒温水浴染色，直至完全染色后取出。染色后，正常心肌组织呈紫黑色，梗死心肌组织无染色。将梗死心肌组织切下，称重，计算心肌梗死面积。心肌梗死面积=梗死心肌组织重量/左心室重量×100%。

1.8 超声检测心脏功能 再灌注24 h后，超声检测大鼠心脏功能。用10%水合氯醛(0.3mL/100 g)腹腔麻醉大鼠，仰卧固定于超声台，用小动物心脏彩色超声心动图检查仪测定大鼠的左室舒张末期内径(Left ventricular internal diameter at diastole，LVIDd)和左室收缩末期内径(Left ventricular internal diameter at systole，LVIDs)，并经电脑软件自动算出左室射血分数(Left ventricularejection fraction，EF)。

1.9 Western blot检测心肌组织 Akt、pAkt、GSK-3b、pGSK-3b蛋白表达 取左室前壁心肌组织，剪成碎片，常规提取心肌组织蛋白，BCA法定量蛋白以调节浓度。每组取蛋白样品50μg上样；SDS-PAGE电泳；转至NC膜，将膜置于含5%脱脂奶粉TBST中，避光封闭1 h；漂洗后，将膜置于一抗稀释液(Akt稀释比1∶1 000、pAkt稀释比1∶2 000、GSK-3b稀释比1∶500、pGSK-3b稀释比1∶500)中，4℃孵育过夜；漂洗后，将膜置于二抗稀释液(1∶1 000)中，室温振荡孵育1 h；漂洗后，滴加ECL发光液，曝光3次，选取重叠值。用Image pro plus7.0软件分析蛋白杂交条带灰度值，以β-actin作为内参蛋白。

1.10 统计学方法 本研究利用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，计量资料采用(±s)表示，t检验；计数资料用“率”描述，用χ2检验。当P＜0.05时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 I/R大鼠模型制备成功情况 I/R模型制备总成功率为67.33%，模型组19只合格，辛伐他汀组22只合格，粉防己碱小剂量组20只合格，粉防己碱中剂量组19只合格，粉防己碱高剂量组21只合格。

2.2 各组大鼠血清cTnT含量及CK-MB、LDH活性检测结果比较 见表1。与假手术组比较，模型组血清cTnT含量及CK-MB、LDH活性均显著升高(P＜0.05)；与模型组比较，粉防己碱中、高剂量组及辛伐他汀组血清cTnT含量及CK-MB、LDH活性均显著降低(P＜0.05)，而粉防己碱低剂量组差异无统计学意义；随着粉防己碱给药浓度的升高，血清cTnT含量及CK-MB、LDH活性逐渐降低，呈剂量依赖性(P＜0.05)。

2.3 各组大鼠心肌梗死面积检测结果比较 见图1，表2。NBT染色后正常心肌组织呈紫黑色；梗死心肌组织呈苍白色，定量分析发现，与假手术组比较，模型组心肌梗死面积显著增大(P＜0.05)；与模型组比较，粉防己碱中、高剂量组及辛伐他汀组心肌梗死面积均显著减小(P＜0.05)，而粉防己碱低剂量组差异不具有统计学意义；随着粉防己碱给药浓度的升高，心肌梗死面积逐渐减小，呈剂量依赖性(P＜0.05)。

表1各组大鼠血清cTnT含量及CK-MB、LDH活性检测结果(±s)

表1各组大鼠血清cTnT含量及CK-MB、LDH活性检测结果(±s)

与假手术组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别假手术组模型组粉防己碱低剂量组粉防己碱中剂量组粉防己碱高剂量组辛伐他汀组n 10 10 10 10 10 10 cTnT(ng/mL)0.83±0.08 1.62±0.17①1.48±0.15①1.34±0.20①②1.16±0.18①②1.12±0.22①②CK-MB(U/mL)752.46±104.24 1 053.37±215.32①891.65±164.77①862.42±126.83①②842.94±156.61②833.15±173.65②LDH(U/mL)1 119.48±213.56 1 594.62±315.22①1 458.34±205.36①1 332.45±212.98①②1 288.34±186.03②1 275.16±145.59②

图1 各组大鼠心肌梗死情况

表2 各组大鼠心肌梗死面积检测结果比较(±s)

表2 各组大鼠心肌梗死面积检测结果比较(±s)

与假手术组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别假手术组模型组粉防己碱低剂量组粉防己碱中剂量组粉防己碱高剂量组辛伐他汀组n666666梗死面积比例(%)0 23.64± 4.29①18.57± 3.86①14.83± 4.10①②7.64± 0.89①②6.57± 1.27①②

2.4 各组大鼠心脏功能检测结果比较 见图2、表3。超声心动图检测结果显示，与假手术组比较，模型组心脏LVIDd、LVIDs均显著增大(P＜0.05)；与模型组比较，粉防己碱低、中、高剂量组及辛伐他汀组心脏LVIDd、LVIDs均显著减小(P＜0.05)；随着粉防己碱给药浓度的升高，心脏LVIDd、LVIDs逐渐减小，呈剂量依赖性(P＜0.05)。

2.5 各组大鼠心肌组织Akt、pAkt、GSK-3b、pGSK-3b蛋白表达结果比较 见图3、表4。Western blot结果显示，与假手术组比较，模型组心肌组织pAkt/Akt、pGSK-3b/GSK-3b比值显著减小(P＜0.05)；与模型组比较，粉防己碱低、中、高剂量组及辛伐他汀组心肌组织pAkt/Akt、pGSK-3b/GSK-3b比值均显著增加(P＜0.05)；随着粉防己碱给药浓度的升高，心肌组织pAkt/Akt、pGSK-3b/GSK-3b比值逐渐增加，呈剂量依赖性(P＜ 0.05)。

图2 各组I/R大鼠心脏功能检测结果

表3 各组大鼠超声心动图检测结果(±s)

表3 各组大鼠超声心动图检测结果(±s)

与假手术组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别假手术组模型组粉防己碱低剂量组粉防己碱中剂量组粉防己碱高剂量组辛伐他汀组n 8 8 8 8 8 8 LVIDd(cm)0.59±0.07 0.78± 0.04①0.66± 0.02①②0.61± 0.03①②0.56±0.02①②0.53±0.04②LVIDs(cm)0.36±0.05 0.47± 0.03①0.42± 0.02①②0.39± 0.02①②0.37± 0.02①②0.36± 0.03①②EF(%)77.72±12.51 49.24±8.67①53.06± 5.94①56.73±6.23 65.92± 3.55②72.65± 3.48②

图3 各组大鼠心肌组织Akt、pAkt、GSK-3b、pGSK-3b蛋白表达结果比较

表4 各组大鼠心肌组织pAkt/Akt蛋白相对表达灰度值(±s)

表4 各组大鼠心肌组织pAkt/Akt蛋白相对表达灰度值(±s)

与假手术组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别假手术组模型组粉防己碱低剂量组粉防己碱中剂量组粉防己碱高剂量组辛伐他汀组n888888 pAkt/Akt 0.618±0.036 0.284± 0.043①0.436± 0.032①②0.784± 0.041①②0.967±0.048①②0.884± 0.044①②pGSK-3b/GSK-3b 0.638±0.037 0.312± 0.031①0.506± 0.034①②0.752± 0.039①②1.073± 0.048①②0.914± 0.042①②

3 讨论

AMI的发生主要是由于冠状动脉阻塞而引起的心肌缺血，40～60岁的中老年人易患心肌缺血。尽快恢复缺血心肌组织的血流供应是临床治疗AMI的有效方法，但I/R所引起的心肌损伤严重影响患者的预后。I/R易造成心肌超微结构及代谢发生变化，反而扩大了心肌梗死面积，并加剧了心脏功能障碍[7～8]。粉防己碱作为一种生物碱，具有多种生物学功能[9]。本研究通过结扎冠状动脉左前降支成功建立了I/R大鼠模型，从血清心肌酶活性、心肌梗死面积、心脏功能等方面，探讨了粉防己碱对大鼠I/R的影响以及相关机制。

I/R会破坏细胞膜脂质双份子层，增加胞膜透过性，进而造成细胞中众多酶CK-MB、LDH等进入血液[10～11]。随着心肌损伤程度加重，血清心肌酶及cTnT有一定程度的上升[12～14]。本研究结果显示，模型组血清cTnT含量、CK-MB活性、LDH活性均显著高于假手术组，提示I/R大鼠心肌组织出现损伤。经粉防己碱治疗后cTnT、CK-MB、LDH活性降低，说明粉防己碱有助于保护I/R大鼠心肌细胞，减轻心肌细胞膜受损程度以及心肌酶的释放。NBT染色发现，正常心肌组织呈紫黑色，梗死心肌组织呈苍白色；经定量分析发现，模型组心肌梗死面积较假手术组显著增大，经粉防己碱治疗后心肌梗死面积显著减小，说明粉防己碱有助于减少I/R大鼠的心肌梗死面积。心肌梗死后会造成心脏功能下降，受损程度与心肌梗死面积呈正相关[15]。模型组心脏LVIDd、LVIDs较假手术组均显著增大，经粉防己碱治疗后心脏LVIDd、LVIDs显著减小，说明粉防己碱能保护心肌I/R损伤后的心脏功能，与辛伐他汀效果相当。

大量研究显示，Akt/GSK-3b信号通路在拮抗心肌缺血梗死方面发挥关键作用[16～18]。Akt作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它可协同磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶1/2促进三磷酸磷脂酰肌醇与其自身结合，Akt由胞浆转移至质膜，同时Akt位点Ser473与Thr308发生磷酸化，Akt蛋白激酶活性开启，被激活的Akt可活化下游一系列蛋白，如GSK-3b。GSK-3也是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为糖原合成代谢的关键限速酶。GSK-3包括GSK-3a和GSK-3b两种亚型，GSK-3a定位于染色体19q13.2上，其编码蛋白的分子量为51 kDa；GSK-3b定位于染色体3q13.3上，其编码蛋白的分子量为47 kDa。GSK-3高度保守，其两种亚型的同源性高达84%。GSK-3不仅参与糖原的合成，而且在细胞增殖、运动、分化、凋亡等方面发挥重要作用[19]。研究显示GSK-3b是位于Akt通路下游的一个重要信号蛋白，Akt通路能够使GSK-3b的ser9发生磷酸化，进而导致GSK-3b失去活性激活下游的靶分子，减少心肌梗死面积，抑制心肌细胞凋亡，发挥保护心脏功能[20]。本研究结果显示，模型组心肌组织 Akt/pAk、pGSK-3b/GSK-3b比值显著减小，经粉防己碱治疗后心肌组织pAkt/Akt、pGSK-3b/GSK-3b比值逐渐增加，说明Akt/pAk、pGSK-3b/GSK-3b与I/R大鼠心肌损伤有关，且粉防己碱保护I/R大鼠心肌组织可能与激活Akt/GSK-3b信号通路有关。然而心肌I/R发生发展机制复杂，粉防己碱缓解心肌I/R的具体作用机理还需深入探究。