马铃薯皮黄酮提取工艺优化及其抗氧化性研究

江震宇 陈佳静 葛宇飞 陈 卓 程林润 徐丽珊

(浙江师范大学化学与生命科学学院1，金华 321004) (金华市农业科学研究院2，金华 321017)

马铃薯(Solanumtuberosum)俗称土豆，茄科茄属一年生草本植物。由于其产量高、营养丰富，目前马铃薯已经成为中国第5大粮食作物，2011年我国马铃薯种植面积达到542.67 万公顷，总产量8 835.02万t，占粮食总产量的15.51%[1]。

马铃薯皮是马铃薯加工和消费中产生的主要副产品，一般不被人们所利用。马铃薯皮的丢弃不仅导致了废物处理问题，而且造成了食品行业的重大经济损失。研究表明，马铃薯皮中富含黄酮类、生物碱、花青素、绿原酸等化合物[2-5]，其中黄酮类化合物具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤、抗炎、降血糖、降血脂等多种保健功效[6-7]。

近年来，已有研究者对马铃薯皮黄酮进行了初步的研究[8-10]，然而目前鲜见关于微波辅助提取马铃薯皮黄酮工艺的报道。微波辅助提取技术是国内外常用的植物活性成分提取技术[11]，其主要是依靠微波场来加速活性成分的溶出。菜籽油是我国南方常见的食用油之一，其极易发生氧化，氧化产物对人体具有毒副作用。因此本实验采用单因素实验法和响应面法优化微波辅助提取马铃薯皮黄酮的工艺条件，并通过测定马铃薯皮黄酮对DPPH·的清除能力及对菜籽油储存过程中过氧化值的影响研究其抗氧化活性，以期为充分利用马铃薯资源，实现马铃薯皮的“废物再利用”，开发绿色、安全、高效的天然马铃薯皮抗氧化剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马铃薯(中薯3号)：金华市农科院，洗净取其皮(厚度1～2 mm)，100 ℃杀青后60 ℃烘干，粉碎过筛备用。菜籽油：购于榨油厂，选取新鲜的菜籽用物理方法压榨而成，无任何添加成分。

芦丁、维生素C(VC)等标准品：美国Sigma公司；2,2-二苯基-1-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)：日本东京化成工业公司；AB-8大孔吸附树脂：上海蓝季科技发展有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、三氯甲烷等均为国产分析纯：金华医药公司。

1.2 仪器与设备

FW135粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱：上海恒科技有限公司；R-210旋转蒸发器：瑞士布奇公司；MDS-8G微波消解仪：上海新仪微波化学科技有限公司；HWS28恒温水浴锅：上海恒科学仪器有限公司；UV-2550紫外分光光度计：日本岛津公司。

1.3 马铃薯黄酮提取液的制备

一定质量的马铃薯皮粉和乙醇溶液，按一定液固比(mL∶g)，充分混合后进行微波辅助提取。提取结束后，提取液于4 ℃，4 500 r/min离心10 min，取上清液定容，即得马铃薯皮黄酮提取液。

1.4 马铃薯皮黄酮含量的测定

采用硝酸铝显色法[12]，测定马铃薯皮提取液的黄酮含量。以芦丁溶液浓度为横坐标， 510 nm处的吸光值为纵坐标绘制标准曲线，吸光度(y)与芦丁浓度(x)(0～0.3 mg/mL)之间的关系为y=11.6x-0.002，相关系数为R2=0.999 6。吸取5.0 mL待测样品液于10.0 mL试管中，加入0.2 mL 5% NaNO2溶液，混匀。静置6 min后加入0.2 mL 10% Al(NO3)3溶液，混匀，静置6 min，再吸取1.0 mL1 mol/L NaOH加入试管，混匀，静置15 min，于510 nm处测定样品的吸光值，根据式(1)，计算出黄酮含量。

(1)

式中:y为样品于510 nm处的吸光度；n为样品被稀释的倍数；V为提取液的体积/mL；m为马铃薯皮粉末的质量/g。

1.5 单因素实验

分别考察提取温度50、60、70、80、90 ℃；微波功率500、600、700、800、900 W；提取时间15、20、25、30、35 min；液固比(mL∶g)15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1；乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%对马铃薯皮黄酮得率的影响。从实验结果分析确定考察区间，以此作为响应面中心组合设计实验方案的基础。

1.6 响应面法优化提取工艺

根据单因素实验结果，确定微波功率为700 W、提取时间为25 min，以黄酮得率为响应值(Y)，以乙醇浓度(A)、液固比(B)、提取温度(C)为自变量，采用Box-Behnken中心组合设计实验，通过建立模型分析实验结果，以确定提取的最佳工艺条件。

1.7 马铃薯皮黄酮的制备及纯化

按最佳工艺条件提取马铃薯皮黄酮，得到的提取液于50 ℃减压浓缩近干，真空干燥，得马铃薯皮黄酮。取一定质量的马铃薯皮黄酮将其完全溶解，加入2 g 活化后的AB-8大孔吸附树脂，于恒温振荡器(28 ℃)振荡吸附4 h，弃去未吸附的溶液，加入一定量的95%的乙醇溶液，于恒温振荡器(28 ℃)振荡吸附2 h。收集解析液于50 ℃减压浓缩近干，真空干燥，得马铃薯皮黄酮纯化物，按照1.4的方法测定其黄酮含量。

1.8 体外抗氧化活性测定

1.8.1 DPPH·清除活性

参照Liu等[13]方法，将不同浓度的马铃薯皮黄酮溶液和VC溶液(阳性对照)各1 mL与2 mL 0.15 mmol/L的DPPH·溶液(70%乙醇配制)混匀后，避光反应30 min，于517 nm处测定吸光值Ai；1 mL 70%乙醇溶液与2 mL DPPH·溶液混匀后，避光反应30 min，于517 nm处测定吸光值Ac；将不同浓度的马铃薯皮黄酮和VC溶液各1 mL与2 mL 70%乙醇溶液混匀后，避光反应30 min，于517 nm处测定吸光值Aj，按式(2)计算清除率。

(2)

1.8.2 菜籽油抗氧化活性

1.8.2.1 马铃薯皮黄酮提取物对菜籽油过氧化值的影响

采用Schaal烘箱法进行测定[14]，在装有等质量的菜籽油广口瓶中分别加入油重0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%的马铃薯皮黄酮，振荡混匀，以VC为阳性对照，菜籽油为空白对照，置于(65±1) ℃的烘箱，24 h后测定菜籽油的过氧化值。根据上述结果，选取适合的黄酮浓度进一步实验，在装有等质量的菜籽油广口瓶中分别加入等质量百分比的马铃薯皮黄酮和VC，以菜籽油为空白对照，每间隔24 h测定试样的过氧化值。

1.8.2.2 过氧化值的测定

参照GB/T 5009.37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》[15]中的4.2.2比色法进行测定。绘制标准曲线，得到吸光度(y)与铁质量(x)的标准曲线关系为y=0.030 36x-0.081 58，R2=0.998 07。相同方法测定样品的吸光值，根据式(3)，计算过氧化值。

(3)

式中：c为由标准曲线计算得到样品中的铁质量/μg；c0为由标准曲线计算得到零管中的铁质量/μg；V1为样品稀释总体积/mL；V2为样品测定取样体积/mL；m为样品质量/g。

1.9 数据处理

本实验所有数值均为三次以上测定值，以平均值±标准偏差表示，实验数据采用SPSS软件分析，P<0.01为差异极显著，0.01≤P≤0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

由图1可知，随着提取温度的增加，马铃薯皮黄酮得率先增加后减小，在70 ℃达到最大值(5.69±0.21) mg/g，之后便迅速下降。当微波功率由500 W上升到700 W时，马铃薯皮黄酮得率随之而增加，在700 W时达到最大值(6.02±0.04) mg/g，800 W后含量趋于平缓，因此选取700 W为最佳微波功率。马铃薯皮黄酮得率随着提取时间的增加先增加后缓慢减少，在25 min时达到最大值(6.03±0.49) mg/g，据此，拟定最佳的提取时间为25 min。当液固比在15∶1～20∶1之间时，马铃薯皮黄酮得率逐渐增加，当达到20∶1时，得率最高为(6.17±0.17) mg/g，当液固比大于20∶1时，黄酮得率呈现下降趋势。当乙醇体积分数由50%上升至70% 时，马铃薯皮黄酮随之增加，在70%时达到最大值(5.97±0.11) mg/g，乙醇浓度继续上升时，黄酮得率显著下降。

图1 五因素对马铃薯皮黄酮得率的影响

2.2 响应面优化马铃薯皮黄酮提取工艺

2.2.1 实验设计及结果

在单因素实验的基础上，确定在微波功率700 W、提取时间25 min的条件下，分别以乙醇浓度(A)、液固比(B)、提取温度(C)为考察因素，以黄酮得率为实验指标，根据Box-Behnken中心组合设计原理，设计三因素三水平分析实验，实验设计及结果见表1。

表1 实验设计及结果

2.2.2 回归模型显著性检验及方差分析

通过Design-Expert 8.05b响应面分析软件分析，方差如表2所示。得到马铃薯皮黄酮得率(Y)对自变量乙醇浓度(A)、液固比(B)、提取温度(C)的二次多项回归方程：Y=6.46-0.21A+0.25B-0.091C-0.32AB+0.099AC+0.17BC-1.06A2-0.89B2-0.77C2。F检验显示模型具有很高的F值和极低的P值(P<0.01)，说明模型高度显著。失拟项为0.081 6，没有达到显著水平，表明所建立的回归模型可以用来分析该工艺条件。在一次项中的A、B以及二次项中的A2、B2、C2对黄酮得率的影响达到极显著水平，C达到显著水平，这表明这3个因素与黄酮得率有直接的关系，是影响得率的主要因子。

注：P<0.01，差异极显著**；P<0.05，差异显著*

图2 各因素交互作用对马铃薯皮黄酮得率的影响

2.2.3 交互作用分析

响应面图形是控制其中一个因素在0水平，响应值对应其余2个因素所做的三维曲面图和等高线图，其可以直观地反映出各因素及其两两之间的交互作用对响应值的影响[16-17]。由图2a可以看出乙醇浓度和液固比具有明显的交互作用，当提取温度一定时，黄酮得率随着液固比的增大而增大，达到最大值后变为下降，而液固比对响应值的影响也与其相类似；图2b显示乙醇浓度与提取温度之间具有明显的交互作用，当液固比一定时，黄铜得率随着乙醇浓度的升高而升高，达到最大值后随即降低，提取温度对黄酮得率的影响也与之相类似；图2c显示液固比与提取温度也具有明显的交互作用，固定乙醇浓度不变，随着液固比的增大，黄酮得率先升高后降低，提取温度对黄酮得率的影响也呈现此规律。

2.2.4 最佳工艺条件确定与验证

通过Design-Expert 8.05b软件分析，马铃薯皮黄酮类物质提取的最佳条件是乙醇浓度68.78%，液固比20.81∶1，提取温度70.34 ℃。在最佳提取条件下预测黄酮得率最大值为6.49 mg/g。综合考虑实际，确定最后修正的最佳工艺条件为：乙醇体积分数70%、液固比20∶1、提取温度70 ℃，在此条件下验证实验，结果显示黄酮得率为(6.50±0.06) mg/g，与模型预期值差异不显著。说明该优化结果可靠，可以用于指导马铃薯皮黄酮的提取工艺。

2.3 马铃薯皮黄酮的制备及纯化

通过该最优条件制备得到的马铃薯皮黄酮，其得率为(29.87±0.08)%，黄酮含量为(21.80±0.03) mg/g。根据1.7所述方法对马铃薯皮黄酮进行纯化，得到纯化后的马铃薯皮黄酮纯化物，其中黄酮含量达到(657.92±0.07) mg/g。

2.4 马铃薯皮黄酮抗氧化活性的研究

2.4.1 马铃薯皮黄酮对DPPH·的清除作用

马铃薯皮黄酮对DPPH·的清除能力结果如图3所示。可以看出，随着浓度的升高，其对DPPH·的清除能力也随之增强。计算得到马铃薯皮黄酮对DPPH·清除率的IC50值为(1.02±0.07) mg/mL，与VC的IC50[(7.96±0.03) μg/mL]相比虽较大，但其仍然具有较好的DPPH·清除能力。同时发现其IC50与马铃薯皮黄酮纯化物的IC50[(30.18±0.02) μg/mL]所成的倍数关系刚好与两者黄酮含量所呈倍数相当，说明马铃薯皮中的黄酮类物质是使马铃薯皮黄酮具有良好的清除DPPH·能力的主要物质。

图3 马铃薯皮黄酮对DPPH·的清除能力

2.4.2 马铃薯皮黄酮抗菜籽油抗氧化的作用

以VC为阳性对照，研究24 h后不同浓度的马铃薯皮黄酮对菜籽油的抗氧化性，见图4。当质量为油重的0.02%时，马铃薯皮黄酮缓解菜籽油过氧化值上升的效果已与相同浓度的VC作用相当。当质量≥油重的0.04%时，其对菜籽油的抗氧化作用显著、极显著优于VC。不同时间马铃薯皮黄酮、以及与其黄酮含量相当的马铃薯皮黄酮纯化物对菜籽油过氧化值的影响见图5。随着时间的增加，加入马铃薯皮黄酮、马铃薯皮黄酮纯化物的菜籽油过氧化值极显著低于空白菜籽油，且两者对菜籽油过氧化值的影响无显著差异，说明马铃薯皮中的黄酮类物质是使马铃薯皮黄酮具有良好的抗菜籽油氧化能力的主要物质。

图4 马铃薯皮黄酮及VC对菜籽油过氧化值的影响

图5 不同时间马铃薯皮黄酮对菜籽油过氧化值的影响

3 结论

本研究在单因素实验的基础上，通过响应面法对微波提取马铃薯皮黄酮工艺进行优化，得到其最佳工艺条件为：乙醇体积分数70%、液固比20∶1、提取温度70 ℃、微波功率700 W、提取时间25 min，此时黄酮的得率为(6.50±0.06) mg/g。通过该最优条件制备得到的马铃薯皮黄酮，其得率为(29.87±0.08)%，黄酮含量为(21.80±0.03)mg/g。使用AB-8大孔吸附树脂对马铃薯皮黄酮进行初步纯化，使其黄酮含量升至(657.92±0.07) mg/g。

对马铃薯皮黄酮进行抗氧化活性测定，发现其具有较好的DPPH·清除能力，清除率的IC50为(1.02±0.07) mg/mL。同时发现马铃薯皮黄酮具有良好的抗菜籽油氧化活性，当质量为油重的0.02%时，马铃薯皮黄酮缓解菜籽油过氧化值上升的效果与相同浓度的VC作用相当。当质量≥油重的0.04%时，马铃薯皮黄酮对菜籽油的抗氧化作用显著优于VC。综上所述，马铃薯皮黄酮具有较好的抗氧化活性，进一步的实验表明，马铃薯皮中的黄酮类物质是使其具有抗氧化活性的主要功效物质。

综合分析，马铃薯皮中富含黄酮类物质，且其黄酮提取物具有较好的DPPH·清除能力和抗菜籽油氧化能力，可进一步研制成天然抗氧化剂，用于防止或延缓食品的氧化。