无创DNA检测技术在产前筛查中的临床应用

冯菊梅

摘 要：目的 探讨无创DNA基因检测技术应用于产前筛查中的临床价值及意义。方法 回顾性分析在我院2015年1月～2017年1月针对553例孕妇包括预产期年龄≥35岁的高龄产妇、唐筛结果为高风险、临界风险或单项指标异常、超声软指标等孕妇。在充分知情同意，进行遗传咨询后选择胎儿无创DNA产前检测，对检测结果为高风险孕妇进一步进行染色体核型分析，对低风险孕妇进行电话追踪随访。结果 553例孕妇外周血中，541例低风险，12例高风险，在高风险病例中7例提示21三体异常；2例提示18号染色体异常；1例提示13三体异常；2例提示胎儿性染色体异常；无创DNA检测结果为高风险的12例孕妇，均進行了羊水或脐血穿刺，7例21三体高风险中7例为47，XN，+21；2例18三体高风险者中1例为47，XN，+18，1例为46，XN；1例13三体高风险者中1例为47，XN，+13；2例性染色体异常中，1例为XXY，1例为45X。并对无创DNA检测阴性的出生新生儿进行随访，未诉明显异常。应用无创DNA检测技术诊断胎儿染色体疾病的敏感度为100.00%，特异度为99.91%，假阴性率为0，假阴性率为0.09%，无创DNA产前检测对21三体，13三体和性染色体的符合率为100.00%，对18三体的符合率为50.00%。结论 无创DNA检测技术在产前筛查中准确性高，假阳性和假阴性低的优点，可提高产前筛查效率，减少染色体疾病患儿的出生，是快捷、安全、较介入性产前诊断易于接受、值得推广的安全可靠的产前筛查方法，是今后发展的必然趋势。但无创DNA检测出的高风险孕妇，也必须进行羊水穿刺进一步确诊。

关键词：无创DNA检测技术；胎儿非整倍染色体疾病；无创产前筛查；临床应用

中图分类号：R440；R714.55 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.10.022

文章编号：1006-1959（2018）10-0073-04

Clinical Application of Noninvasive DNA Detection Technology in Prenatal Screening

FENG Ju-mei

（Guangyuan Maternal and Child Health Hospital，Guangyuan 628000，Sichuan，China）

Abstract：Objective To explore the clinical value and significance of noninvasive DNA gene detection technology in prenatal screening.Methods The retrospective analysis of 553 pregnant women，including pre maternity age≥35 years old，in our hospital in January 2017-January 2015，was high risk，critical risk or abnormal single index，and ultrasonic soft index.After fully informed consent，the prenatal detection of fetal noninvasive DNA was selected after genetic counseling.The chromosome karyotype analysis was carried out for the pregnant women with high risk，and the low risk pregnant women were followed up by telephone follow-up.Results In 553 pregnant women， 541 cases had low risk and 12 cases had high risk.Among the high risk cases，7 cases showed trisomy 21 abnormality，2 cases showed chromosome 18 abnormality，1 case showed 13 trisomy abnormality and 2 cases showed fetal sex chromosome abnormality.12 cases of high-risk non-invasive DNA test results were performed with amniocentesis or umbilical cord blood puncture.Among the 7 cases with high risk of trisomy 21，7 cases were of 47，XN，+21；Of the 2 cases of 18 trisomy high risk，1 were 47，XN，+18， 1 cases were 46，XN；1 cases 13 trisomy high risk patients，1 cases were 47，XN，+13；2 cases of sex chromosomal abnormalities，1 case was XXY and 1 was 45X.Follow up was also made for the neonates born with noninvasive DNA test，and no complaints were found.The sensitivity of the noninvasive DNA detection technique was 100.00%，the specificity was 99.91%，the false negative rate was 0，the false negative rate was 0.09%，the coincidence rate of noninvasive DNA prenatal detection for 21-3 body，13-3 body and sex chromosome was 100.00%，and the coincidence rate for 18-3 body was 50.00%. Conclusion Non invasive DNA detection technique has the advantages of high accuracy，false positive and low false negative in prenatal screening.It can improve the efficiency of prenatal screening and reduce the birth of children with chromosomal diseases.It is a safe and reliable prenatal screening method which is easy to be accepted and worthy of popularization.It is an inevitable trend in the future development.But noninvasive DNA detection of high-risk pregnant women must also be further diagnosed by amniocentesis.

Key words：Noninvasive DNA detection technology；Fetal aneuploidy diseases；Noninvasive prenatal screening；Clinical application

我国是出生缺陷的高发国。据2012年中国出生缺陷防治报告显示，目前我国出生缺陷率约为5.6%，每年新增出生缺陷儿约90万例，染色体疾病是最为严重的出生缺陷之一[1]。染色体异常造成的出生缺陷，存活下來的出生患儿多为终生残疾或智力障碍，无法治愈，由此给社会造成了严重的经济负担，对家庭造成的心理负担和精神痛苦更是无法用金钱来衡量。染色体异常中最为常见，包括21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征及Turner综合征，但迄今为止尚无有效治疗手段。目前只能通过产前检测预防患儿出生。临床二级预防出生缺陷的主要方法是通过血清学筛查，但目前国内临床应用比较广泛的孕中期产前筛查模式，是通过孕妇血清标志物水平间接反映胎儿情况，存在一定的假阳性和假阴性。 侵入性绒毛、羊水/脐血穿刺可能造成流产，感染等风险。 无创DNA检测技术的临床开展，无疑是一个不错的选择，它具有无创优点的同时，将对21、18、13三体综合症的检出率提高到99%，作为一种新的近似于产前诊断的产前筛查技术，降低出生缺陷。对2015年1月～2017年1月我院产科进行无创DNA检测的孕妇553例，进行检测研究分析，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料 选择2015年1月～2017年1月在广元市妇幼保健院产科进行无创DNA检测的孕妇553例。年龄19～38岁，平均年龄（29.88±2.31）岁，孕周13～22+6周，平均孕周（6.50±1.89）周，单胎540例、双胎13例。其中87例是产筛高风险含高龄预产期孕妇，年龄≥35周岁；243例临界风险或单项指标异常；29例直接无创DNA检测（含错过唐筛时间者）；194例超声染色体软指标：如心室强回声、NT异常、脉络丛囊肿等。对产筛高风险的孕妇均得到遗传咨询及充分的告知并了解了无创DNA检测技术的局限性及风险性，并签署知情同意书。对于无创DNA检测出的高风险结果再进行羊水及脐血培养和核型分析以明确诊断。

1.2方法 标本采集采用EDTA真空采血管采集静脉血5 ml，于2～8 C°保存，在2 h内离心分离血浆提取DNA，在冷链条件下运送到四川省妇幼保健院检验中心进行胎儿DNA分析。实验室提取母体外周血血浆中游离DNA片段，进行高通量测序，将每条DNA片段测序所得的序列与人类基因组图进行比对，从中筛选每一条染色体上完全相吻合DNA序列总数。根据生物学统计原理，进行生物信息分析，确定胎儿染色体是否存在非整倍性变化的风险值。产后随访：对所有检测结果呈阳性的孕妇，追踪妊娠结局。同时对于检测结果为阴性的孕妇做好观察随访，确定无漏诊率。

2结果

2.1唐氏筛查结果 2015年1月～2017年1月，在我院产科进行7853例孕妇唐氏筛查后共有高风险432例，高风险率5.50%，其中21三体337例，阳性率4.30%，18三体59例，阳性率0.75%，开放性神经管缺陷（ONTD）高风险36例，阳性率0.45%。

2.2三种检测方法结果对比 在所有无创DNA检测的553例孕妇外周血中，541例提示低风险，12例提示高风险。高风险孕妇进行羊水/脐血的检测结果为1例阴性，其余11例与无创DNA检测结果一致，见表1。

2.3无创DNA检测异常结果与羊穿核型分析比较 12例无创DNA产前检测对21三体，13三体和性染色体的符合率为100.00%，对18-3体的符合率为50.00%，见表2。

2.4 随访结果 541例无创DNA检测低风险的孕妇均已完成电话随访541例，已经出生胎儿541例，目前家属口述正常健康；12例无创DNA检测高风险的孕妇依据染色体核形分析异常结果引产11例，其中7例胎儿明显畸形，4例胎儿畸形不明显的分别为47，XN， +21（3例）和45.X.（1例）。1例无创DNA检测高风险的孕妇依据染色体核形分析1例为46XN，目前已经出生胎儿家属口述正常健康。应用无创DNA检测技术诊断胎儿染色体疾病的敏感度为100.00%（11/11），特异度为99.91%（540/541），假阴性率为0（0/553），假阴性率为0.09%（1/553），无创DNA产前检测对21三体，13三体和性染色体的符合率为100.00%，对18三体的符合率为50.00%。

3讨论

染色体数目异常或结构异常所致的疾病称为染色体疾病，染色体疾病患者常表现为智力低下，发育迟缓，虽然医疗技术在不断进步，但目前为止，染色体异常还没有有效的治疗方法[2]。胎儿染色体三体是孕妇需要进行产前筛查的一个主要原因，21三体是胎儿三体综合征的最常见类型，每年的发病率为1/800-1/600[3]。本研究发现7例21三体综合征，2例18三体综合征，1例13三体综合征，主要临床表现为多发畸形，2例性染色体异常超声下未见明显异常。目前产前筛查及产前诊断成为避免染色体疾病患儿出生的重要手段之一。

近十余年，我国在预防出生缺陷方面做了大量卓有成效的工作，结合血清学筛查、超声检查和产前诊断，大大降低了出生缺陷的发生率。但目前应用最为广泛的中孕期三联血清学产前筛查，它针对特定的没有任何相应疾病提示的人群（如所有的孕妇人群），通过检查将其中患某一疾病可能性较大的高危人群筛选出来，以进行其后的诊断性检查，减少胎儿的丢失率[4]。血清学筛查在三体综合征的诊断及某些出生缺陷筛查有一定的应用价值。但是中孕期三联血清学筛查技术仍然存在较低的检出率（70%）和较高的假阳性率（5%）[5]。较低的检出率导致“漏诊”的发生，给社会和家庭带来了沉重的经济负担；而较高的假阳性率增加了不必要的侵入性产前诊断，给受检孕妇带来了极大的心理负担，增加了正常胎儿丢失的风险，大大降低了产前诊断的依从性。

本组研究中553例血清学筛查高风险孕妇经无创DNA检测结果异常为12例，羊水穿刺、细胞培养、胎儿染色体核型分析确诊染色体异常11例，其中包括21三体综合征7例、18三体2例，13三体1例，性染色体异常2例。

胎儿无创DNA产前检测是利用大规模平行测序技术对母体外周血中的游离DNA进行深度测序，获取胎儿染色体信息的方法，从而得出染色体数目异常风险程度的判断。新一代测序技术的新型无创DNA产前检测，对孕妇外周血中存在的胎兒游离DNA进行检测，通过生物信息学统计分析发现胎儿染色体是否存在21、18、13号染色体三体，与血清学筛查相比，其准确性和特异性较高[6]。游离胎儿DNA主要来源于胎盘组织，其在母血体血浆中的含量可能与胎盘屏障功能关系密切。如果存在胎盘发育不良、胎盘破损等胎盘屏障功能障碍，可能会导致母体血浆中游离胎儿DNA含量下降而影响检测结果[7]。本研究中发现12例无创DNA检测异常孕妇中羊水穿刺染色体正常为1例，11例筛查结果与羊水穿刺结果相一致，敏感度为100.00%（11/11），特异度为99.91%（540/541），假阴性率为0（0/552），假阴性率为0.09%（1/552），无创DNA产前检测对21三体，13三体和性染色体的符合率为100.00%，对18三体的符合率为50.00%。相比于血清学筛查，无创DNA筛查更加准确，误诊率低，有效地避免不必要的侵入性产前诊断。

但胎儿无创DNA测序技术有一定的局限性，主要表现：①对染色体三体疾病中的双胎，多胎情况，检测技术的灵敏度与特异性可能会下降；②孕妇1年内接受过异体输血、移植手术、异体细胞治疗等；③筛查的目标疾病少，仅对21三体，18三体，13三体整倍体异常，不能检测出胎儿染色体异位、倒位，微缺失等染色体结构异常疾病，且对三体疾病中存在部分嵌合体，检测存在难度[8]；④孕妇本人为染色体疾患患者或携带者；⑤孕期合并恶性肿瘤；如无法检出可由细胞遗传学方法检出的其他染色体结构异常，只对特定染色体检出率高。筛查高风险结果还是需要经羊水穿刺或绒毛，脐血穿刺给予确认。

我国全国产前诊断技术专家于2012年就无创DNA检测技术进行了论证。边旭明等[9]指出，该检测技术是一种“近似于诊断水平”、“目标疾病指向精确”的产前筛查，应与现有的产前筛查体系相结合，准确把握临床适用人群，包括：①有介入性产前诊断先兆流产、发热、有出血倾向、感染未愈等禁忌证者；②产筛高危或临界风险高危孕妇；③珍贵儿，知情后拒绝介入性产前诊断的孕妇；④对介入性产前诊断极度焦虑的孕妇；⑤就诊时处于较大孕周，超出目前产前筛查范围的孕妇。目前无法对其余的染色体进行检测，且不能分析染色体结构上的异常。相比于血清学筛查，其费用较高，无创DNA检测技术尚未全面普及。如何对它的应用范围、技术局限有清晰的认识、如何对患者进行正确的临床指导，有赖于进一步的研究和经验积累。正确有效的咨询能够使患者充分了解各项技术的利弊并选择最有利于自身的方案.除此之外，本研究发现无创DNA检测技术对于性染色异常的检出率高达100.00%。

因此，本研究建议首先可通过传统的血清学筛查从广大普通孕妇人群中发现高危者，然后采用无创DNA检测技术对这些高危者进行筛查，对异常者再进一步进行介入性手术，同时向孕妇充分解释这些方法的可行性、有效性、局限性和相应结局的风险，由知情权衡后个体化选择。这项技术有效规避了流产和感染带来的风险，并可极大降低孕妇及家属的心理负担，代表了当前产前检测和防止先天性缺陷儿出生的最新发展方向。随着二胎政策的开发，高龄孕妇的增多，对于出生缺陷的防控也是重中之重，虽然无创DNA高风险结果仍需其他产前诊断技术进行确诊，但它在孕妇产检过程中减少了孕妇对羊膜腔穿刺技术的恐惧，而且无创DNA取代血清学筛查是趋势，对于产前筛查来说无创是一项重要的技术补充手段，无创性产前诊断技术无疑是一个充满活力的全新的发展方向。

参考文献：

[1]边旭明.胎儿染色体非整倍体的无创DNA产前检测[J].实用妇产科杂志，2013，29（5）：330-333.

[2]吴清明，周瑾.出生缺陷产前筛查及产前诊断研究进展[J].中国优生与遗传杂志，2011，19（1）：129-131.

[3]Driscoll DA，Gross S.Clinical practice prenatal screening for aneu-ploidy[J].N Engl J Med，2009，360（24）：2556-2562.

[4]ACOG Practice Bulletin No.88，December 2007.Invasive prenatal testingfor aneuploidy[J].ObstetGynecol，2007，110（6）：1459-1467.

[5]余海燕，刘新会，主编.出生缺陷的产前诊断与围生期处理[M].第1版.成都：四川大学出版社，2015.

[6]蔡婵慧，郭莉，胡晶晶，等.4636例高龄孕妇羊水细胞染色体分析[J].中国优生与遗传杂志， 2014，22（08）：35-37.

[7]李玉芝，任景慧，林琳华，等.大规模并行基因组测序技术应用于无创产前诊断染色体非整倍体的研究[J].华中科技大学学报（医学版），2012，41（4）：475-480.

[8]王兰玲，陶华娟，王执勇，等.346例孕妇无创DNA产前检测结果分析[J].中国优生与遗传杂志，2014，22（6）：62-64.

[9]边旭明，蒋宇林，戚庆炜.产前诊断，走中国自已的道路[J].中华妇产科杂志，2017，47（11）：801-803.

收稿日期：2018-2-2；修回日期：2018-2-15

编辑/李桦