凡纳滨对虾感染虾肝肠胞虫的群体及组织间差异性分析*
2018-08-31程东远宋增磊万晓媛谢国驷
程东远 邱 亮 宋增磊 万晓媛 董 宣 谢国驷 黄 倢
凡纳滨对虾感染虾肝肠胞虫的群体及组织间差异性分析*
程东远1,2邱 亮1,2宋增磊1,2万晓媛1董 宣1谢国驷1黄 倢1,2①
(1. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 农业农村部海水养殖病害防治重点实验室 青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071；2. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306)
对来自河北黄骅(HH)、山东平度(PD)、江苏吴江(WJ)和山东日照(RZ)的4个凡纳滨对虾()群体进行了对虾生长参数测量，用TaqMan qPCR检测了凡纳滨对虾各群体的肝胰腺组织中和RZ群体多种组织中的虾肝肠胞虫数量(Amount of, EHP)。结果显示，在主要生长相关参数中，RZ群体最优，该群体EHP载量也最低。不同群体的样本数EHP对数直方图的模式存在差异，HH和PD群体的EHP对数呈双峰分布，而WJ和RZ群体的EHP对数呈单峰分布，代表EHP在不同群体中可能存在不同的传播模式。EHP对数呈单峰分布的群体或从多峰分布的群体中分离出的高EHP对数子群体的对虾体长或体重与EHP对数呈显著的负相关。RZ群体中，各个体不同组织中EHP从高到低的顺序依次是肝胰腺>中肠>血淋巴>鳃>肌肉。肝胰腺、中肠和鳃3个组织中EHP对数相互间的相关性为99.9%的极显著水平(<0.001)；除了中肠与血淋巴和肝胰腺与血淋巴以外，其余组织间EHP对数的相关性也达到极显著(<0.01)或显著(<0.05)水平。用DIG标记的EHP探针对肝胰腺、肌肉、鳃、肠道组织的原位杂交显示，肝胰腺是主要的EHP感染组织，其他组织中杂交信号较弱，但各组织中有少数细胞的EHP易感。
凡纳滨对虾；虾肝肠胞虫；生长参数；原位杂交
虾肝肠胞虫(, EHP)是泰国Tourtip等(2009)描述的微孢子虫新种，属于真菌界(Fungi)、微孢子虫门(Microsporidia)、单倍期纲(Haplophasea)、壶孢目(Chytridiopsida)、肠胞虫科(Enterocytozoonidae)、肠胞虫属() (鲁兴萌等, 1999; Samtom, 2001; Tang, 2015)，严格细胞内寄生(Lom, 2002; Phelps, 2007)。自2003年以来，泰国养殖斑节对虾()出现生长缓慢综合征(MSGS)，造成了严重的经济损失(Chayaburakul, 2004)。Tourtip等(2009)在生长缓慢的斑节对虾肝胰腺中检测到EHP，但感染EHP在组织病理学上难以诊断，重度感染的对虾肝胰腺在常规的苏木精-伊红染色下，很难观察到特征性的病理变化，而通过原位杂交则能显示凡纳滨对虾()感染EHP后，其肝胰腺小管上皮细胞中存在明显杂交信号(Tang, 2015)。感染EHP的凡纳滨对虾肝胰腺、粪便及养殖对虾水体能经PCR检测检出EHP阳性(Han, 2016; Tang, 2016; Rajendran, 2016)，其肝胰腺、鳃、血淋巴、肠、心脏、肌肉组织也均可检测到EHP阳性(Han, 2016; Santhoshkumar, 2016; 骆云慧等, 2016)，但不同组织中EHP载量的差异及相互关系还不明确。
中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖生物疾病控制与分子病理学研究室检测发现，在我国养殖凡纳滨对虾中，自2013年起有很高的EHP阳性率，刘珍等(2016)建立了EHP的SYBR Green I实时荧光定量检测方法。对3批凡纳滨对虾样品检测表明，EHP与对虾生长率呈一定的负相关关系，肝胰腺中EHP在103copies/ng DNA以上可能代表较高的风险。而EHP载量较低时，则EHP感染与对虾生长的相关性尚不明确。目前，对EHP的检测多以肝胰腺为目标组织，其他组织EHP检测有效性不明。因此，本研究对不同自然感染的凡纳滨对虾群体的EHP与生长相关性开展进一步研究，并对不同组织EHP载量的差异进行定量检测和原位杂交验证。
1 材料与方法
1.1 实验动物来源
于2016年6月26日、7月20日、9月14日和9月20日自河北黄骅(HH)、山东平度(PD)、江苏吴江(WJ)和山东日照(RZ) 4个凡纳滨对虾养殖场分别采集放苗养殖40~80 d的凡纳滨对虾样品共274尾(表1)。其中，HH群体养殖时间为54 d，PD群体养殖时间为60 d，WJ群体养殖时间为40 d，3个群体均表现为生长缓慢，个体差异较大；RZ群体养殖时间为80 d，在4个群体中养殖期最长，生长接近正常。
上述HH、PD和WJ群体样品为现场取样，保存于3倍体积的95%乙醇中，带回实验室进行体长()和体重()测量。RZ群体凡纳滨对虾装于塑料袋中，充纯氧后运送至实验室，经暂养后，抽取对虾血淋巴至1.5 ml离心管中，置于–80℃冰箱中保存。将对虾沿中线剖为两半，一半用置于Davideson’s AFA固定液(Bell, 1998)中固定24 h，再保存于70%乙醇中；另一半分别取凡纳滨对虾的整个肝胰腺、中肠、第1腹节肌肉、鳃丝，置于1.5 ml离心管中，于–80 ℃冰箱保存。
1.2 群体生长相关参数计算方法
为了对不同放苗时间的各群体进行生长比较，根据各群体放苗后的养殖天数()，假定放苗时平均体长(L)为1 cm，并用体重指数=×–3的关系估计放苗时平均体重(W)，推算各群体的体长日增长率(Daily growth rate of length, DGL, %/d)和体重的日增长率(Daily growth rate of weight, DGW, %/d)。公式如下：
DGL = (–L)/(L´)×100%
DGW = (–W)/(W´)×100%
1.3 样品核酸提取
将乙醇保存的样品倒去乙醇，用无RNase水冲洗后充分研磨；–80℃冰箱保存的样品置于冰上融化后充分研磨。取30 mg研磨匀浆液，用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司, 北京)提取DNA。用核酸分析仪(Nanodrop 2000c, Thermo Scientific)进行浓度测定，于–20℃冰箱保存。
1.4 EHP定量标准制备
取实验室制备的EHP标准重组质粒菌株(Liu, 2017)，接种到1 ml LB液体培养基中(含氨苄青霉素100 μg/ml)，37℃恒温培养箱中培养4~5 h，再按1%的量接种到5 ml LB培养基。置于37℃恒温培养箱中，200 r/min揺瓶培养约12 h。取4 ml培养液，用Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0(TaKaRa, 大连)质粒小提试剂盒按说明书方法提取质粒，所提取质粒溶解在50 μl Elution Buffer中。用核酸分析仪(Nanodrop 2000c, Thermo)测定提取质粒样品的核酸浓度，计算质粒拷贝数。按10倍梯度稀释成108~ 100copies/µl的梯度作为Man qPCR标准品。
表1 对虾群体样品采集信息
Tab.1 The sampling information of shrimp populations
1.5 EHP的TaqMan qPCR检测
采用Liu等(2017)建立的TaqMan实时荧光定量检测方法进行EHP定量检测。定量所用引物和探针序列分别为F168 (5¢-AGT AAA CTA TGC CGA CAA-3¢)、R168 (5¢- GCG TTG AGT TAA ATT AAG C -3¢)和TaqMan探针(5¢-FAM-TCC TGG TAG TGT CCT TCC GT-TAMRA-3¢)。引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，实时荧光定量反应体系为20 µl包含10 µl 2× Premix Ex™ Probe qPCR体系(TaKaRa, 大连)，0.8 µl 10 μmol/L引物F186，0.8 µl 10 μmol/L引物R186，0.4 µl 10 μmol/LMan探针，7 µl无RNase水，1 µl模板DNA。扩增反应在实时荧光定量PCR仪(CFX96, BIO-Rad)中进行，反应扩增程序为95℃ 30 s预变性后，95℃ 5 s和60℃ 30 s，进行40个循环后终止反应。
1.6 EHP原位杂交用DIG探针制备
根据GenBank中的EHP SSU rDNA (KF362129)序列，用Primer Premier 5.0设计了原位杂交探针合成引物，Probe-F (5¢-AGC CAT TGA GTT TGT TGA-3¢)和Probe-R (5¢-TTT CGC CTC CGT TG-3¢)，引物序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。扩增产物为144 bp。在50 μl反应体系中，包含0.25 µl Exversion 2.0 (TaKaRa, 大连)，5 μl 10×Buffer (TaKaRa，大连)，3 μl 20 mmol/L MgCl2, 5 μl DIG-dNTP Mix (Roche, 上海)，2 μl 10 µmol/L引物Probe-F，2 μl 10 µmol/L引物Probe-R，31.75 µl无RNase水，1 μl DNA模板。反应在94℃预变性2 min后，于94℃ 30 s，47℃ 30 s，72℃ 30 s进行30个循环，最后72℃ 2 min延伸。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.7 原位杂交
原位杂交基本按照Bruce等(1993)的方法进行。Davidson’s AFA固定后的组织样品经脱水、透明和石蜡包埋，制备4 µm石蜡切片，于65℃烘片4 h，切片复水处理，经10 μg/ml蛋白酶K于37℃消化30 min，再经0.4%预冷的甲醛固定5 min。于42℃进行预杂交30 min，与DIG标记探针于42℃杂交12 h，经漂洗和封闭后，用1∶1000碱性磷酸酶偶联的抗DIG抗体(Roche，上海)于37℃反应30 min，再经漂洗后，用NBT/BCIP避光显色2~3 h，终止后用0.5% Bismarck Brown Y复染，经脱水、透明和封片，在显微镜下观察。
1.8 数据分析
相关性分析采用Microsoft Excel的数据分析加载项计算数据间相关系数()，根据不同样本数和不同显著性水平的相关系数临界值，判断相关性的显著性水平。未特别注明的，以<0.05为显著差异水平，以<0.01为差异极显著水平。
2 结果
2.1 凡纳滨对虾群体生长特征
对各群体进行体长和体重测量(表2)。4个群体体长差异从大到小依次为PD>HH>RZ>WJ，体长日增长率从小到大依次为WJ
表2 对虾群体样品生物学信息
Tab.2 The biological information of samples from shrimp populations
注：标注不同小写字母表示显著差异（<0.05）
Note: Data in the same line marked with different lowercases means significant difference (<0.05)
2.2 不同群体中EHP的TaqMan qPCR检测
对4个凡纳滨对虾群体样品进行实时荧光定量检测。结果显示，4个凡纳滨对虾群体样品肝胰腺中EHP载量和阳性率各不相同(表3)。HH群体阳性检出率为77.8%，考虑到qPCR的灵敏度，将阴性样品的EHP对数值归零，得4个群体中阳性率从高到低顺序分别为WJ>RZ>PD>HH，总平均EHP对数从高到低的顺序是PD~WJ>HH~RZ，其中，PD与WJ无显著差异，HH和RZ无显著差异，PD、WJ群体与HH、RZ群间差异显著。
2.3 各群体EHP的分布特征
对4个群体EHP对数的分布进行分析(图1)。结果显示，HH群体的EHP对数分布为0.11~3.42，呈近正态分布，但在分布中的值为2.0~2.4范围内的数量降低，其分布呈2个有所重叠的双峰状态(图1a)；PD群体的阳性样本的EHP对数分布为0.88~5.88，但分布峰值为0.8~2.8和3.2~6.0 2个完全分离的区域 (图1b)；WJ群体的阳性样本的EHP对数分布在0.52~ 4.40范围，为标准的正态分布，在2.8~3.2位置呈单峰值(图1c)；RZ群体阳性样本的EHP对数分布为0.19~ 2.62，呈类泊松分布，峰值位于0.4~0.8位置(图1d)。从主要样本的EHP分布范围的宽度来看，PD>HH> RZ>WJ，WJ和RZ群体中，各个体的EHP感染水平较为接近，而PD和HH群体中，各个体的EHP感染水平差异大。
表3 4个养殖凡纳滨对虾群体中肝胰腺EHP检出情况
Tab.3 EHP detection in hepatopancreas from 4 populations of farmed L. vannamei
EHP指每ng组织总DNA中EHP SSU rDNA拷贝数，下表同
EHP means copies of EHP SSU rDNA per ng tissue total DNA, the same as below
图1 各群体感染EHP水平的分布
a：黄骅群体；b：平度群体；c：吴江群体；d：日照群体。
EHP指每ng组织总DNA中EHP SSU rDNA拷贝数。灰色方块为实际样本数统计，黑色虚线为分布趋势 a: HH; b: PD; c: WJ; d: RZ.
EHP means copies of EHP SSU rDNA per ng tissue total DNA, the same as below. Gray blocks are based on actual statistics, while dotted black lines show distribution trends
2.4 不同群体EHP与生长参数的相关性
分别对4个群体凡纳滨对虾肝胰腺EHP对数与对虾的体长、体重和体重指数等生长参数进行线性相关性分析(表4)。
HH群体样品数量=54，显著相关0.05=±0.268，EHP对数与体长、体重和体重指数的相关性均无95%的显著性意义，其中，EHP对数与体重指数=0.2155，介于0.2=0.177和0.1=0.226之间，达到80%显著性水平。根据该群体EHP双峰分布，将其分为EHP低的子群HH1 (=32)和EHP高的子群HH2 (=22)，HH2的EHP对数与体长和体重的相关系数分别为-0.452和-0.517，均达到了显著相关水平(0.05=0.423，<0.05) (图2a和图2b)。
PD群体样品数量=42，显著相关0.05=±0.304，EHP对数与体长、体重和体重指数均无显著相关，其中，EHP对数与体长和体重相关系数分别为–0.2174和–0.2280，介于0.1=–0.257和0.2=–0.202之间，负相关性具有80%显著性水平(<0.01)。根据该群体EHP双峰分布，将该群体分为EHP低的子群PD1 (=22)和EHP高的子群PD2 (=20)，PD2的EHP对数与体长和体重的相关系数分别为–0.377和–0.467，体重相关性达到0.05=–0.444的95%显著性水平(<0.05)，体长相关性接近90%显著性水平(图2c和图2d)。
WJ群体样品数量=132，显著相关0.05=±0.171，EHP对数与3个生长指数的相关系数均未达到95%的显著性水平(>0.05)，其中，EHP对数与体重的相关系数=–0.1635<0.1=–0.144，具有90%的显著性水平(<0.01)(图2e和图2f)。
RZ群体样品数量=48，显著相关0.05=±0.285，其中，EHP对数与对虾体长=–0.2949，表明该群体的EHP与体长存在显著负相关性(<0.05)，EHP与体重的相关系数为=–0.2782<0.1=–0.240，负相关性具有90%的显著性水平(<0.01)，EHP与体重指数的系数=–0.1909<0.2=–0.188，负相关性具有80%的显著性水平(<0.2)(图2g和图2h)。
2.5 不同组织中EHP的TaqMan qPCR检测
分别对RZ群体样品的肝胰腺、肠道、肌肉、血淋巴和鳃5种组织进行实时荧光定量检测，检测结果显示，该群体5种组织中EHP载量各不相同，且5种组织中EHP阳性率也有差异(表5)。其中，肝胰腺的EHP最高，阳性率也最高；其次是中肠，EHP对数是肝胰腺的84.1%；再次是血淋巴，EHP对数是肝胰腺的76.2%；鳃EHP对数是肝胰腺的62.7%，其阳性率最低；肌肉的EHP对数是肝胰腺的15.1%。
2.6 不同组织间EHP载量的关系
对RZ群体各个体的5种组织中的EHP对数进行组织间的相关性分析(表6)。根据RZ群体的48个样品，确定95.0%、99.0%、99.5%和99.9%的显著性水平的相关系数0.05分别为0.285、0.368、0.399和0.460。相关性分析表明，不同组织之间的EHP均有正相关趋势，从值大小来判断，肝胰腺、中肠和鳃3种组织相互之间的EHP对数相关性最强，超过99.9%的显著性水平，其他依次为肠道与肌肉、鳃与肌肉、肝胰腺与肌肉、肌肉与血淋巴、肠道与血淋巴等组织之间的EHP对数，这些均有极显著相关性；肝胰腺与血淋巴和鳃与血淋巴的EHP对数的相关性没有达到95.0%的显著性水平。
表4 4个养殖凡纳滨对虾群体中肝胰腺EHP与生长指标的相关性分析
Tab.4 Correlation analysis between EHP in hepatopancreas and growth indexes of 4 populations of farmed L. vannamei
注：标注0.02的数据表示有98%的显著相关性(<0.02)，标注0.05的数据表示有95%的显著相关性(<0.05)，标注0.1的数据表示相关的显著性水平达到90% (<0.1)，未标注数据表示无显著性差异(>0.1)
Note: Data marked with 0.02 means 98% significant relationship (>0.02); data marked with 0.05 means 95% significant relationship (>0.05); data marked with 0.1 means 90% significant relationship (<0.1); data without superscript means no significant relationship (>0.1)
图2 4个养殖凡纳滨对虾群体中肝胰腺EHP与体长和体重的相关性
a，b：HH群体；c，d：PD群体；e，f：WJ群体；g，h：RZ群体；标注*为95%显著相关性(<0.05)
a, b: Population HH; c, d: Population PD; e, f: Population WJ; g, h: Population RZ; Data marked with * means 95% significant correlation (<0.05)
表5 RZ群体凡纳滨对虾各组织中EHP载量和阳性率
Tab.5 The detection of EHP from the tissuse of RZ population of L. vannanmei
表6 不同组织EHP对数间的相关性
Tab.6 Relationship of logarithmic EHP between different tissues
注：标注0.001的数据表示有99.9%的极显著相关性(<0.001)，标注0.005的数据表示有99.5%的极显著相关性(<0.005)，标注0.01的数据表示有99.0%的极显著相关性(<0.01)，标注0.05的数据表示有95.0%的显著相关性(<0.05)
Note: Data marked with 0.001 means 99.9% highly significant relationship (<0.001); data marked with 0.005 means 99.5% highly significant relationship (<0.005); data marked with 0.01 means 99.0% highly significant relationship (<0.01); data marked with 0.05 means 95.0% significant relationship (<0.05)
2.7 不同组织中EHP的感染情况
取RZ群体不同组织进行原位杂交。结果显示，EHP阴性样品没有杂交信号，EHP阳性样品表现出杂交信号，对照样品没有出现任何杂交信号，表明所用的EHP探针杂交特异性良好。肝胰腺、肌肉、鳃、中肠中均可观察到杂交信号，在这些组织中，肝胰腺组织切片杂交信号最多且较强，视野中大约5%~10%的细胞呈现阳性；肌肉和鳃组织中杂交信号较少且较弱；肠道中仅在中肠部位观察到杂交信号，中肠内 容物的杂交信号强，中肠上皮细胞内的杂交信号弱(图3)。
3 讨论
本实验室前期对虾肝肠胞虫与凡纳滨对虾生长的相关性已经有相关研究。结果显示，EHP在103copies/ng HPDNA以上时，表现出较高的风险水平，且与对虾的生物学生长呈现一定的负相关性，但在较低的差异范围内，EHP与凡纳滨对虾生长的相关性不显著。本研究分别从河北黄骅、山东平度、江苏吴江和山东日照采集到4个凡纳滨对虾群体，其中，在生长相关各参数上RZ群体最优。qPCR测定表明，RZ群体肝胰腺EHP也是最低的。对EHP对数的分布进行统计表明，WJ、RZ群体的EHP对数分布为单峰，各个体的EHP载量接近；而HH、PD群体分布为双峰，各个体的EHP载量差异大。这种分布可能提示WJ、RZ群体主要是单一感染，而HH、PD群体可能存在群体内2次或多次传播。对群内EHP与凡纳滨对虾生长参数的相关性分析表明，RZ群体的肝胰腺EHP对数与对虾体长呈现显著的负相关性(<0.05)，与对虾体重也呈较显著的负相关性(<0.1)，WJ群体的EHP对数与体重呈现较显著的负相关性(<0.1)，而HH和PD群体整体上EHP对数与对虾生长参数的相关性均未达到显著水平；但根据EHP对数的分布将HH和PD群体各分为EHP低和高的2个子群后，EHP高的子群中与对虾体长或体重间出现了显著或较显著的相关性。上述结果说明，EHP对数与对虾生长参数的相关性与EHP感染的时间点有重要关系，这可以解释前期研究中某些群体的EHP与对虾生长参数呈现显著负相关性，但另一些群体中没有明显相关性的现象(刘珍等, 2016; 刘亚梅等, 2017; 刘宝彬等, 2017)，EHP感染主要发生在较相近的时间点时，这种负相关性才能较明显；群体中存在2次传播或感染在不同时间点时，后续感染可能就扰乱了这种相关性。
本研究对凡纳滨对虾不同组织进行EHP检测，RZ群体是4个群体中EHP载量最低，但阳性率较高的群体，个体间肝胰腺EHP载量比较接近，这可能是由于该群体受到较低水平EHP传染源的感染所致，如经水体传播的EHP孢子的感染，该群体有利于对不同组织间的EHP进行分析。qPCR检测结果表明，EHP从高到低的顺序依次是肝胰腺>中肠>血淋巴> 鳃>肌肉；而检出率高低顺序在肌肉和鳃略有差异。经相关性分析表明，各组织EHP对数总体上有正相关性，肝胰腺、肠道和鳃三者之间的相关性达到99.9%的极显著水平(<0.001)，肌肉-鳃、肝胰腺-肌肉、肌肉-血淋巴、肠道-血淋巴等组织间也呈极显著相关性(<0.01)。这显示EHP主要感染的组织可能是肝胰腺和肠道，用血淋巴、鳃或肌肉进行定量或定性检测，能一定程度地反映肝胰腺中的EHP感染情况，但在感染水平较低时，可能存在较多的假阳性比率。Santhoshkumar等(2016)、Salachan等(2017)研究表明，用常规PCR在对虾肝胰腺、鳃、血淋巴、肠、心脏、肌肉组织均可检测到EHP阳性，但这些研究未揭示不同组织间EHP载量的关系及阳性率的高低。
图3 感染虾肝肠胞虫凡纳滨对虾不同组织的原位杂交
a：肝胰腺；b：鳃；c：肌肉；d；中肠；e：肝胰腺阴性对照
a: Hepatopancreas; b: Gills; c: Muscle; d: Midgut; e: Negative control of hepatopancreas
前人在组织病理学观察及原位杂交的研究表明，肝胰腺和肠道中能观察到EHP的感染(Tang, 2015; Rajendran, 2016; Santhoshkumar, 2016)，但在其他组织上未观察到感染的证据。为了说明EHP在不同组织中的检出是属于污染还是组织内的感染，作者对RZ群体的不同组织进行了原位杂交检测，结果显示，RZ群体中较低的EHP感染水平下，对虾肝胰腺中的杂交信号比以往报道中所看到的(Tang, 2015, Salachan, 2007)数量要少得多，大约5%~10%的细胞显示为阳性，但在所检测的几种组织中是最多的；中肠的原位杂交结果则显示，肠腔内容物中出现出较强的杂交信号，中肠上皮细胞中也出现较弱的杂交信号；此外，在鳃和肌肉细胞中也观察到少量杂交信号，但信号强度相对较弱。这说明EHP可能造成肝胰腺以外的组织感染，但细胞感染率和感染强度低。
本研究通过qPCR获得了EHP在凡纳滨对虾不同群体和不同组织中感染量的准确数据。群体内EHP载量的分布特点表示，EHP在群体内可能存在2次或多次传播，群体中EHP感染发生在较相近的时间点时，其量与凡纳滨对虾的生长参数呈显著的负相关性。EHP能在多组织中检出，各组织EHP载量有显著相关性，其中，肝胰腺和中肠中分布最多，肝胰腺是EHP检测的最灵敏组织；原位杂交显示，EHP在其他组织中的存在是因为在其他组织中存在一定水平的感染，中肠内容物中存在原位杂交信号，表明EHP可能通过粪便进行传播，粪便也可作为检测的样品。EHP在对虾群体和体内的感染和分布情况能为该病的诊断和预防研究提供基础数据。
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(编辑 陈严)
Differences Between Populations and Tissues ofInfected with
CHENG Dongyuan1,2, QIU Liang1,2, SONG Zenglei1,2, WAN Xiaoyuan1, DONG Xuan1, XIE Guosi1, HUANG Jie1,2①
(1. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao); Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Qingdao Key Laboratory of Mariculture Epidemiology and Biosecurity; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)
Growth-related parameters of individuals from four populations offrom Huanghua of Heibei Province (HH), Pingdu of Shandong Province (PD), Wujiang of Jiangsu Province (WJ), and Rizhao of Shandong Province (RZ) were assessed. Amount of(EHP) in the hepatopancreas of individuals from all populations and EHP in multiple tissues of shrimp from the RZ population were assessed withMan-based quantitative PCR. The results showed that the RZ population possessed optimal growth-related parameters and the lowest EHP among the four populations. The histograms of case-logarithmic EHPs of the four populations presented different modes. The case distribution of logarithmic EHPs from the HH and PD populations showed double peaks, while those of the WJ and RZ populations showed a single peak. The different distribution modes may indicate a different EHP spread in the four populations. The population with a single peak mode or the higher logarithmic EHP subpopulation isolated from the population with a multiple peak mode showed a significant negative correlation with shrimp body length or body weight to logarithmic EHP. The EHP detected in different tissues of the RZ population followed the order (from highest to lowest), EHP in hepatopancreas > EHP in midgut > EHP in hemolymph > EHP in gills > EHP in muscle. The logarithmic EHP in the hepatopancreas–midgut, hepatopancreas–gills, and midgut–gills had a significant correlation level above 99.9% (<0.001), while the logarithmic EHP of the other two tissues had a significant correlation level above 99.0% (<0.01) or above 99.5% (<0.05), except for midgut–hemolymph and hepatopancreas–hemolymph.hybridization of a DIG-labeled EHP probe in the hepatopancreas, muscle, gills, and midgut showed that the hepatopancreas is the major target tissue of EHP infection in shrimp. Minor and weak hybridization signals were also observed in other tissues, which indicated that a few cells in those tissues were also susceptible to EHP infection in.
;; Growth parameters;hybridization
HUANG Jie, E-mail: huangjie@ysfri.ac.cn
10.19663/j.issn2095-9869.20170426001
S945
A
2095-9869(2018)04-0083-10
* 中国东盟海上合作基金项目(2016-2018)、青岛海洋科学与技术试点国家实验室鳌山科技创新项目(2015ASKJ02)、现代农业产业技术体系(CARS-47)、948计划(2016-X56)和山东省泰山学者建设工程专项共同资助 [This work was supported by China ASEAN Maritime Cooperation Fund Project (2016-2018), Project of the Aoshan Science and Technology Innovation Program of Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02), China Agriculture Research System (CARS-47), 948 Program (2016-X56), and the Construction Programme for Distinguished Taishan Scholars of Shandong Province of China]. 程东远：E-mail: cheng_dong_yuan@163.com
黄 倢，研究员，E-mail: huangjie@ysfri.ac.cn
2017-04-26,
2017-06-01
程东远, 邱亮, 宋增磊, 万晓媛, 董宣, 谢国驷, 黄倢. 凡纳滨对虾感染虾肝肠胞虫的群体及组织间差异性分析. 渔业科学进展, 2018, 39(4): 83–92
Cheng DY, Qiu L, Song ZL, Wan XY, Dong X, Xie GS, Huang J. Differences between populations and tissues ofinfected with. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(4): 83–92
