HPLC法同时测定复方骆驼蓬子凝胶剂中6种成分的含量

李 敏， 焦 敏， 王长虹， 李 岩

(1新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011; 2上海中医药大学中药研究所, 上海 201203)

复方骆驼蓬子软膏由新疆地产药材骆驼蓬子、天仙子、秋水仙3味药材组成，主治关节酸痛、风湿性关节炎等，具有良好的临床疗效。但复方骆驼蓬子软膏在制剂处方工艺和质量标准上存在问题与缺陷，对药品疗效的发挥造成一定影响。孙婷[1]研制出了复方骆驼蓬子水凝胶贴剂，有效改进了其处方工艺上的缺陷。软膏剂原质量标准中仅有鉴别项，无含量测定项，制剂中3味药材的主要有效成分(骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、鸭嘴花碱、氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品、秋水仙碱)均未检测，而现有针对上述待测化合物的含量测定方法均只能检测出其中1种或2种物质[2-5]。本研究建立了HPLC法同时检测复方骆驼蓬子凝胶剂和软膏剂中6种成分的含量测定方法，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器Waters 2690-2487型高效液相色谱仪(美国沃特世公司)，METILER TOLEDO pH计(梅特勒-托利多公司)，New Classic MF型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)，Milli-Q型艾柯超纯水仪(美国密理博公司)。

1.2试药去氢骆驼蓬碱对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号Z15J7H9148)，秋水仙碱对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号S15A8C34051)，鸭嘴花碱对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号Z05J8S37321)，氢溴酸东莨菪碱对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号Y29J7C18646)，硫酸阿托品对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号M03M7K10353)，骆驼蓬碱对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号Z20J7H9333)，复方骆驼蓬子水凝胶贴剂(新疆医科大学药剂实验室自制，批号20171018-2、20171018-5、20171020-3、20171020-4、20171025-1、20171025-2、20171025-5)，复方骆驼蓬子软膏剂(新疆希望制药有限公司，批号20171018、20171020、20170721、2017022、20171024、20171025)，冰乙酸(天津市大茂化学试剂公司，批号20170801)，甲醇[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司]；乙腈[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司]；甲醇(天津市大茂化学试剂厂，批号20171008)，乙酸铵(天津市北联精细化学品开发有限公司，批号20161120)。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 分别称取鸭嘴花碱2.29 mg、氢溴酸东莨菪碱4.57 mg、硫酸阿托品对照品3.4 mg、骆驼蓬碱4.50 mg、去氢骆驼蓬碱2.56 mg、秋水仙碱0.46 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，作为对照品储备液。

2.1.2 供试品溶液 取复方骆驼蓬子水凝胶贴剂适量，除去防粘纸，将载药无纺布剪碎并至于具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，称重，40℃浸泡提取90 min，放冷，再称重，甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。取复方骆驼蓬子软膏剂适量至于具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL ，密塞，称重，60℃超声提取60 min，放冷，再称重，甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品、鸭嘴花碱、秋水仙碱HPLC含量测定色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相：乙腈-乙酸铵缓冲液(3.4 g乙酸铵+0.5 mL冰乙酸+500 mL水，pH值5.32±0.05),梯度洗脱程序：0～7 min时，乙腈为11%；7～12 min时，乙腈比例过渡至22%；12～24 min时，乙腈比例过渡至27%，保持此梯度16 min。检测波长：250 nm和264 nm；柱温：27 ℃；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL。在此条件下，鸭嘴花碱色谱峰相对保留时间(tR)为(6.95±0.2)min，东莨菪碱色谱峰tR为(13.3±0.2)min，阿托品色谱峰tR为(15.9±0.2)min，骆驼蓬碱碱色谱峰tR为(18.9±0.2)min，去氢骆驼蓬碱色谱峰tR为(20.36±0.2)min，秋水仙碱色谱峰tR为(25.5±0.2)min。在此条件下，6种待测物质与样品中其他成分达到基线分离，见图1。

图1 混合对照品(a)、凝胶剂供试品(b)、软膏剂供试品(c)、空白对照(d)的HPLC图

2.3回归方程的建立量取“2.1.1”项下对照品储备液适量，用甲醇溶液按照逐步稀释法，将对照品储备液配制成系列梯度溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，进样量10 μL，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，见表1。

2.4精密度试验移取复方骆驼蓬子水凝胶剂的同批供试品溶液适量，于1 d内重复进样6次，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液10 μL注入色谱仪，按“2.2”项下色谱条件进行测定并记录色谱图，经计算凝胶剂鸭嘴花碱峰面积RSD为1.0%，氢溴酸东莨菪碱峰面积RSD为1.3%；硫酸阿托品峰面积RSD为0.8%；骆驼蓬碱峰面积RSD为0.3%；去氢骆驼蓬碱峰面积RSD为0.2%；秋水仙碱峰面积RSD为1.0%，表明仪器精密度良好，见表2。

表1 6种待测成分的线性方程、线性范围及相关系数

表2 凝胶剂6种待测物精密度试验结果(n=6)

2.5稳定性试验吸取同一供试品溶液适量，按“2.2”项下色谱条件分别于2、4、6、10、18、24 h进样，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液10 μL注入色谱仪进行测定并记录色谱图，经计算凝胶剂鸭嘴花碱峰面积RSD为2.7%，氢溴酸东莨菪碱峰面积RSD为2.4%；硫酸阿托品峰面积RSD为2.7%；骆驼蓬碱峰面积RSD为0.9%；去氢骆驼蓬碱峰面积为RSD为0.8%；秋水仙碱峰面积RSD为2.6%，表明样品稳定性良好，见表3。

2.6重复性试验取同一批复方骆驼蓬子水凝胶剂样品，按供试品溶液的制备方法制备6份等浓度供试品溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液10 μL注入色谱仪，按照“2.2”项下色谱条件进行测定并记录色谱图，经计算凝胶剂鸭嘴花碱含量RSD为0.4%，氢溴酸东莨菪碱含量RSD为1.8%；硫酸阿托品含量RSD为0.9%；骆驼蓬碱含量RSD为0.7%；去氢骆驼蓬碱含量RSD为0.6%;秋水仙碱含量RSD为2.3%，表明样品重复性良好,见表4。

表3 凝胶剂6种待测物稳定性试验结果(n=6)

2.7加样回收率试验取已知含量的凝胶剂样品(批号20171025-5)6份，分别加入鸭嘴花碱、氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品、骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、秋水仙碱对照品适量,按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制备样品并分别测定6种待测物质的含量，计算加样回收率。结果鸭嘴花碱的平均回收率为90.63%(RSD=1.7%)，氢溴酸东莨菪碱的平均回收率为93.90%(RSD=1.3%)；硫酸阿托品的平均回收率为97.05%(RSD=2.6%)；骆驼蓬碱的平均回收率为104.13%(RSD=1.6%)；去氢骆驼蓬碱的平均回收率为101.70%(RSD=1.9%)；秋水仙碱的平均回收率为101.26%(RSD=7.1%)，见表5。

表4 凝胶剂6种待测物重复性试验结果(n=6, mg/g)

2.8样品含量测定经测定凝胶样品中鸭嘴花碱的平均含量为0.28 mg/g，氢溴酸东莨菪碱的平均含量为0.94 mg/g，硫酸阿托品的平均含量为0.99 mg/g，骆驼蓬碱的平均含量为1.14 mg/g，去氢骆驼蓬碱的平均含量为1.48 mg/g，秋水仙碱的平均含量为0.01 mg/g。软膏样品中鸭嘴花碱的平均含量为0.51 mg/g，氢溴酸东莨菪碱的含量为0.86 mg/g，硫酸阿托品的含量为0.54 mg/g，骆驼蓬碱的含量为2.34 mg/g，去氢骆驼蓬碱的含量为1.60 mg/g，秋水仙碱的含量为0.28 mg/g。

表5 凝胶剂的加样回收率测定(n=6)

3 讨论

3.1梯度洗脱方法的确立本研究对复方骆驼蓬子水凝胶贴剂的含量测定方法进行全面考察，同时也考察了该方法对软膏剂进行含量测定的适用性，参考制剂中主要待测化合物的已有高效液相定量方法[6-14]，尝试采用了乙腈-水系统、乙腈-0.1%甲酸水系统、甲醇-0.5%氨水系统、乙腈-乙酸铵缓冲液系统，通过对比不同流动相系统下各待测物质的峰形及分离度，最终决定选用乙腈-乙酸铵缓冲液系统梯度洗脱。

3.2检测波长的选择据文献[6-14]报道,6种待测化合物的检测波长均不同，筛选不同波长后最终决定采用双通道检测方法，分别选定264 nm及250 nm作为检测波长，其中鸭嘴花碱、氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品、骆驼蓬碱采用264 nm处的吸收进行定量，去氢骆驼蓬碱、秋水仙碱采用250 nm处的吸收作为检测波长。

3.3提取方法的选择预试验时比较了提取溶剂、提取方法及提取时间对复方骆驼蓬子软膏剂及凝胶剂中各待测物质提取程度的影响，结果显示，复方骆驼蓬子水凝胶剂的最佳提取方法为甲醇作为提取溶剂，40℃浸提90 min；复方骆驼蓬子软膏剂的最佳提取方法为甲醇作为提取溶剂， 60℃超声提取60 min。

3.46种成分含量分析复方骆驼蓬子水凝胶剂及软膏剂均由骆驼蓬子、秋水仙及天仙子3味药材制成， 6种待测成分的含量由高至低排列为去氢骆驼蓬碱、骆驼蓬碱、硫酸阿托品、氢溴酸东莨菪碱、鸭嘴花碱、秋水仙碱。由于复方制剂含有诸多辅料、样品中杂质较多、目标待测物质极性、最大吸收波长的差异均较大等原因，原有含量测定方法的有效成分提取工艺都较为复杂；前期研究仅对软膏剂中药材比重较大的骆驼蓬子药材的3种有效成分(骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、鸭嘴花碱)进行了定量研究[3]，未对其它2种占比较低且具有一定毒性成分的药材制定系统、完善的含量测定方法。因此本研究对原有含量测定方法进行优化及完善，可同时测定制剂中的6种有效成分的含量。

研究结果表明，6种待测有效成分在不同批次制剂中含量较为均一，其中含量较低的成分秋水仙碱在各批次间含量差异稍大但其变化在规定范围内。因此本研究采用HPLC法同时测定复方骆驼蓬子水凝胶剂6种成分的方法适用于复方骆驼蓬子水凝胶剂及软膏剂的含量测定，方法简便、准确、可靠、可行，有效地提高了复方骆驼蓬子制剂的质量控制水平并为其标准的提升奠定了基础。