不同海拔间歇性低压低氧预处理对大鼠放射性肝损伤及肝脏组织TNF-α、TGF-β1表达的影响

袁 芳， 李文军， 夏红娟， 美丽姑·买买提， 叶 华， 徐 丽

(新疆军区总医院放疗科， 乌鲁木齐 830000)

间歇性低压低氧预处理(intermittent hypobaric hypoxia preconditioning，IHHP)指将人或动物通过间断或连续地暴露于低压低氧环境，模拟高原适应，适度的低压低氧刺激可有效调动机体的内源性保护机制，以对抗随后严重的外界伤害刺激[1]。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)在细胞生长、分化、组织修复及炎性因子趋化过程中发挥重要的调节作用[2]。本研究对不同海拔间歇性低压低氧预处理对大鼠放射性肝损伤及肝脏组织TNF-α、TGF-β1表达的影响进行研究，以期为放射性肝损伤的预防提供参考依据。

1 材料与方法

1.1材料50只雄性SPF级SD大鼠，购自新疆医科大学实验动物中心，体质量180～220 g/只，饲养在新疆军区总医院动物实验科动物中心(SPF级)。TNF-α、TGF-β1免疫组织化学试剂盒(Abcom公司)。低压低氧环境均在西北特殊环境人工实验舱内(新疆军区总医院)进行。

1.2动物分组50只SD大鼠随机分为5组：对照组(C组)、单纯照射组(R组)、3 000 m间歇性低压低氧预处理联合照射组(IHHP3+R组)，4 000 m间歇性低压低氧预处理联合照射组(IHHP4+R组)、5 000 m间歇性低压低氧预处理联合照射组(IHHP5+R组)，实验开始前适应性饲养1 w。

1.3预处理及照射方法预处理方法：实验中需要的3 000、4 000、5 000 m的高原环境通过实验舱舱模拟，将各组大鼠分批次放进舱中，设置好舱内的高度及温度、湿度，待高度升高到设定的高度后，观察记录大鼠的一般情况，6 h后出舱换下一批，各组大鼠每天进舱1次，6 h/次，5次/w；照射方法：出舱后的大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射(0.1 mL/100 g)麻醉固定后，确定右半肝照射的照射野并在体表标记，采用6 MV X射线，照射总剂量(totall dose，DT)=60 Gy，照射野3 cm×2 cm×1.5 cm，源皮距(source skin distance，SSD) =100 cm，照射深度(d)=1.5 cm，单次剂量2 Gy，1次/d，5次/w。

1.4采血取材及免疫组织化学染色法照射组大鼠照射后6 h， 以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，打开腹腔找到下腔静脉采血检测谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)的变化。采血完成后取1 cm×1 cm×1 cm大小的受照肝组织，10%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，免疫组织化学染色按Abcam试剂盒说明书进行：组织蜡块5 μm连续切片后标记，烤片20 min，脱蜡及再水化：二甲苯5 min， 100%乙醇5 min，95%乙醇2 min，90%乙醇2 min，85%乙醇2 min，80%乙醇2 min；PBS溶液洗2遍，切片进入过氧化氢溶液孵育10 min，再用PBS溶液洗2遍，每遍5 min；滴加蛋白修复液室温放置10 min，PBS溶液洗一遍5 min；滴加一抗，37℃放置1 h；PBS溶液洗4遍，每遍5 min，滴加二抗，室温放置10 min，PBS溶液洗4遍，每遍5 min；滴加过氧化物酶室温放置10 min，PBS溶液洗4遍，每遍5 min；配制DAB显色剂摇匀，滴加显色剂，显色后用PBS溶液洗4遍，每遍5 min； 苏木精染液浸泡40秒，盐酸溶液脱色，蒸馏水冲洗，80%乙醇2 min，90%乙醇2 min，95%乙醇2 min，100%乙醇4 min，二甲苯4 min；树胶封片，镜检。

1.5免疫组织化学法阳性表达判定标准采用半定量分级法，分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度进行评分。阳性着色细胞数：每张切片观察5个高倍镜视野，计数阳性细胞百分比，<5%记为0分，5%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，>75%记为4分；阳性染色强度：无色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。2者所得分数乘积作为阳性等级：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.6统计学处理各组数据采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，多组间计量资料的比较用单因素方差分析，率的比较采用卡方检验，组间比较通过Dunnett-t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1肝功与C组相比，R组大鼠血清ALT、AST水平明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)，与R组相比，IHHP4+R组大鼠血清ALT、AST水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而IHHP3+R组、 IHHP5+R组大鼠血清ALT、AST与R组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 各组大鼠血清ALT、AST水平的比较

注：与C组比较，*P<0.05；与R组比较，△P<0.05。

2.2免疫组织化学检查结果TGF-β1的表达主要在细胞质和细胞核中，TNF-α的表达主要在细胞质，正常大鼠(C组)肝脏TGF-β1、TNF-α呈低表达，染色淡(图1)，R组大鼠肝脏TGF-β1高表达，细胞质及细胞核棕黄色深染，TNF-α高表达，细胞质深染，IHHP3+R组、IHHP4+R组、IHHP5+R组TGF-β1均高表达，细胞质及细胞核也呈棕黄色深染，TNF-α不同程度高表达。R组大鼠肝脏TGF-β1、TNF-α的阳性表达率均明显高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)；IHHP4+R组的TNF-α阳性表达率明显低于R组，差异有统计学意义(P<0.05)；IHHP3+R组、IHHP4+R组、IHHP5+R组TGF-β1的阳性表达率与R组比较差异均无统计学意义(P>0.05)(表2、图1)。

表2 各组大鼠肝脏TNF-α、TGF-β1的表达/例(%)

注：与C组比较，*P<0.05； 与R组比较，△P<0.05。

TGF-β1的阴性表达 (×100)

TNF-α的阴性表达 (×100)

TGF-β1的阳性表达

TNF-α的阳性表达

2.3相关性分析肝功与免疫组化的结果显示，4 000 m海拔高度预处理能对放射造成的肝损伤产生一定的保护作用，本研究对经过4 000 m低压低氧预处理组SD大鼠肝脏TNF-α、TGF-β1的表达以及肝功能指标ALT、AST进行相关性分析，结果显示，经过低压低氧预处理后，TNF-α表达与TGF-β1表达呈负相关(r=-0.802，P=0.005)，TNF-α表达与ALT呈负相关(r=-0.855，P=0.002)，TGF-β1的表达与ALT呈正相关(r=0.648，P=0.043)。

3 讨论

放射性肝损伤是由于放射治疗导致的一种亚急性、慢性肝脏损伤，是胸部和上腹部肿瘤放疗及骨髓移植前预处理中最严重的并发症之一，极大地影响了胸腹部肿瘤，特别是肝癌的放疗疗效[3]，制约着放疗剂量的增加。有研究表明IHHP能够减轻放射性心脏损伤和纤维化[4]。低压低氧预处理对机体具有多种有益作用，如：对抗心脏缺血/再灌注损伤[5]、抗心律失常[6]，并且可以产生神经[7]、肝脏保护作用[8]。近年来关于低压低氧预处理保护作用方面的研究较多，关于低氧放疗的研究也有不少，武亚晶等[9]研究表明慢性间歇性低压低氧预处理可以改善放射线引起的冠状动脉损伤，提高心脏对缺血再灌注损伤的耐受性，通过抑制氧化应激、内质网应激以及抑制心肌纤维化等对心脏肌发挥保护作用。Yuan等[10]的研究结果提示慢性间歇性低压低氧预处理可以通过抑制内质网应激损伤减轻大鼠的肝脏损伤。本研究对不同海拔间歇性低压低氧预处理对大鼠放射性肝损伤及肝脏组织TNF-α、TGF-β1表达的影响进行研究。

TNF-α、TGF-β1在细胞生长、分化、组织修复及炎性因子趋化过程中发挥重要调节作用。TNF-α是由单核巨噬细胞产生的一种生物活性因子，是一种主要的促炎性细胞因子，其表达受转录因子核因子κb(NF-κB)的调控[11]。TGF-β1是一种重要的免疫调节性细胞因子，能抑制巨噬细胞激活，肝损伤时主要由枯否细胞和巨噬细胞释放，肝纤维化时则主要由HSC释放[12]。TNF-α在血液及肝组织的浓度升高，推测TNF-α可能触发肝纤维化的开始，使病变由单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎转变，予以TNF-α抑制剂可明显改善脂肪性肝炎的病变程度[13]。TGF-β1是已知促进HSC激活并分泌胶原纤维的最主要的细胞因子，在肝纤维化形成过程中起关键作用，是最强的致纤维化因子，促进纤维连接蛋白及蛋白多糖等细胞外基质合成与沉积[14]， Yoshida等[15]报道TGF-β1对肝脏的急慢性炎症性疾病有明显的抑制作用，可能与TGF-β1抑制CD4+细胞向辅助性T细胞17(Thl7)细胞分化有关。

大鼠肝脏经过照射后，会出现放射性肝损伤，导致肝功能受损，对肝脏TNF-α、TGF-β1表达产生影响。Wei等[16]研究结果表明RILD大鼠肝功检测ALT、AST以及碱性磷酸酶(ALP)明显增加。本研究结果显示，凡是经过照射的大鼠ALT、AST均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，IHHP组与R组相比，4 000 m高原环境处理后大鼠肝功ALT、AST值有所下降，差异有统计学意义(P<0.05)，3 000、5 000 m高度处理后，大鼠肝功与R组比较差异无统计学意义；C组正常大鼠肝脏TNF-α、TGF-β1呈低表达，R组、IHHP3+R组、IHHP5+R组大鼠肝脏的TNF-α大量表达，IHHP4+R组的TNF-α表达较C组高，较其他组低；TGF-β1在R组、IHHP3+R组、IHHP4+R组、IHHP5+R组均大量表达，与C组相比，R组、IHHP3+R组、IHHP5+R组组TNF-α均高表达，差异有统计学意义(P<0.05)；TGF-β1在R组、IHHP3+R组、IHHP4+R组、IHHP5+R组均高表达，异有统计学意义(P<0.05)；与R相比，IHHP4+R组TNF-α的表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。肝功与免疫组化的结果显示，4 000 m海拔高度预处理能对放射造成的肝损伤产生一定的保护作用，4 000 m低压低氧预处理组SD大鼠肝脏TNF-α、TGF-β1的表达以及肝功能指标ALT、AST的相关性分析结果显示，经过低压低氧预处理后，TNF-α表达与TGF-β1表达呈负相关，TNF-α表达与ALT呈负相关，TGF-β1的表达与ALT呈正相关，说明4 000 m高度预处理对放射性肝损伤的保护作用可能是通过降低TNF-α的表达实现的。

综上所述，间歇性低压低氧预处理对照射后大鼠肝脏TNF-α的表达有一定的影响，合适的预处理高度、预处理的方式会降低TNF-α的表达，而TNF-α表达的降低可能对放射性肝损的减轻发挥重要作用，IHHP也许能为放射防护提供一种新的防治方法，但还需要更多、更大规模的研究进一步证实。