穿心莲内酯微球制备工艺的优化

李春兰 杨小云 孙昌霞

1. 河南中医药大学第一附属医院药房，河南郑州 450001；2. 黄河科技学院医学院药学系，河南郑州 450063

穿心莲内酯是从天然植物穿心莲中提取的主要有效成分之一。药理实验表明，穿心莲内酯在治疗心脑血管疾病方面有显著的疗效，另外还具有抗各种炎症，抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强人体免疫力、保肝利胆等作用，具有毒性小，价格低的特点[1-3]。然而，穿心莲内酯极低的生物利用度、极苦的口感，限制了其在临床上的应用[4]。微球制剂是一种较热门的研究技术，该制剂可以通过调节和控制药物的释放速度使药物缓慢释放，从而达到长效的作用[5]；又能阻止酶的降解，提高药物的稳定性；掩盖药物的苦味；减少服药次数；降低药物的毒副作用，提高疗效[6]。另外，微球粒径较小，具有较好的靶向作用[7]。穿心莲内酯微球的研究未见有报道，该文首次采用乳化交联法制备穿心莲内酯微球，该微球可有效掩盖药物苦味，提高生物利用度，扩大其临床应用范围。

1 材料

实验用材料包括仪器、药品及试剂两大类。

1.1 仪器

FA1004 型电子天平购自上海良平仪器仪表有限公司；HH-2 双孔电子恒温水浴锅购自上海科析试验仪器厂；CJJ79-1 磁力搅拌器购自江苏晓阳电子仪器厂；N-117M 双目显微镜购自上海精密仪器仪表有限公司；TJ270-30 紫外可见分光光度计购自京北普析通用仪器有限公司；TL80-1 型医用离心机购自苏药管械；KQ2200E超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司。

1.2 药品及试剂

穿心莲内酯原料药（含量＞98%，西安开来生物工程有限公司，批号K120308）；穿心莲内酯标准品（含量99%，中国药品生物制品检定所，批号131102） ；司盘-80（天津市四友精细化学有限公司，批号120528）；液体石蜡（天津市四友精细化学有限公司，批号100312）；95% 乙醇（郑州派尼化学试剂厂，批号070320）；甲醛（洛阳市化学试剂厂，批号111008）；异丙醇（天津市德恩化学试剂有限公司，批号120605）；明胶（天津市兴复精细化工研究所 批号120730）。以上试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 穿心莲内酯含量测定方法的建立

2.1.1 选择检测波长 分别称取适量的穿心莲内酯和辅料，置于100mL 容量瓶中，用95% 乙醇在微热条件下溶解定容后过滤备用。分别测定上述两种溶液在200 ～ 400nm 波长范围内的吸光度，结果显示穿心莲内酯在波长225nm 处有最大吸收，且此处辅料无干扰。

2.1.2 绘制穿心莲内酯的标准曲线 精密称取10mg 穿心莲内酯，加适量的95% 乙醇溶解，移入100mL 的容量瓶中，并用乙醇定容，配成0.1mg/mL的储备液。精密移取该溶液适量置于10mL 容量瓶中，用乙醇稀释至刻度，配成浓度分别为5、10、12.5、20和22.5μg/mL 质量浓度的穿心莲内酯标准品溶液，用紫外-可见分光光度计分别测定不同浓度的标准品溶液在225 nm 处的吸光度，以吸光度（A）对浓度（C）作图，得 y=29.122x-0.2382，R2=0.9992 的线性回归方程。结果表明，穿心莲内酯在质量浓度为5.0 ～ 22.5 μg/mL 范围内有良好的线性关系。计算得低、中、高浓度的回收率（%，n=3）分别为 100.33，100.47 和 100.93；RSD（%，n=3）为2.00，0.95 和1.29，精密度、回收率均符合要求。

2.2 微球的制备[8-9]

按乳化交联法，称取一定量的明胶置于小烧杯中，加适量蒸馏水充分膨胀半小时后，置于约60℃恒温水浴锅中，搅拌使其充分溶解，保温备用。精确称取20mg 穿心莲内酯放置于小烧杯中，加入4 mL 液体石蜡，在一定的温度条件下搅拌均匀，并在搅拌状态下加入0.6mL 司盘-80，继续搅拌至能用显微镜观察到大小均匀的O/W 型乳状液，然后将其冷却至0 ～ 4℃，缓缓加入约1mL 化学交联剂 （异丙醇0.625mL 和37% 甲醛0.375mL 混合），用20%的NaOH 溶液调节pH 值至8～9，继续搅拌3h， 离心分离沉淀，沉淀用适量异丙醇离心5min，经过多次洗涤后，在室温下干燥得到淡黄色粉末。

2.3 载药量与包封率

采用可见分光光度法测定药物的载药量与包封率。取微球适量，精密称定，置于研钵中加入适量的95%乙醇2mL 进行充分研磨，倒入试管。在40 ～ 50℃下超声处理1h，放冷，过滤，得样品溶液。精密量取1mL 样品溶液放置于10mL 容量瓶中，用乙醇溶液定容，在225nm 波长处测定吸光度（A），通过标准曲线方程对微球中穿心莲内酯的含量进行计算，得出其包封率、载药量。（包封率= 微球中含药量/ 投药总量×100% ；载药量= 微球中含药量/ 微球总重量×100%）

2.4 正交实验设计

2.4.1 正交试验设计方法与优化[10-12]在单因素实验的基础上，选取3 个影响微球性质较大的因素，即明胶浓度（A） 、温度（B） 、搅拌速度（C），每个因素选定3 个水平（见表1），按L9（3）设计实验，实验优化结果（见表2）。

表1 正交试验水平表

表2 正交实验优化

2.4.2 正交的极差和F比分析 为了考察以上单因素实验中几个因素及其水平对包封率是否有显著影响，确定最佳工艺条件，采用F 比分析，结果见表3。

表3 F比分析表

根据极差分析（表2）和F 比分析（表3）数据可知，各因素对穿心莲内酯微球包封率的影响大小顺序是：A ＞ B ＞ C，结果表明，确定的最优方案为A3B1C2，即明胶浓度为20%，温度为40℃，搅拌速度2000r/min。制得穿心莲内酯微球的平均载药量为3.88%，包封率为23.23%。

2.5 最佳制备工艺验证

按照上述正交设计试验法筛选得到穿心莲内酯的最佳工艺，重复制备3 批微球，所制得微球均为淡黄色粉末。显微镜下观察微球的外观形态，所得微球圆整、均匀，分散性、无粘连。采用可见光分光度法测定微球中所含穿心莲内酯的含量，并计算载药量与包封率，得其平均载药量为3.92%，包封率为25.01%。

2.6 外观形态观察[13]

所得微球为淡黄色粉末，将微球置于双目显微镜下观察，可见微球分散均匀，无粘连。见图1 ～ 2。

图1 初乳（×40倍镜）

图2 微球（×40倍镜）

3 讨论

本实验采用正交法对交联乳化法制备穿心莲内酯的工艺进行了优化，确定了最佳工艺，并进行了最佳验证，结果表明此工艺工艺简单、重现性好，易于操作，制备微球有一定的优势。制备的微球圆整，均匀，具有分散型好，无粘连的优势。并用灵敏度高，准确度高，重现性好的紫外分光光度法测定了微球中所含穿心连内酯的含量，结果显示了穿心连内酯在波长225nm 处有最大吸收，且此处没有辅料的干扰，标准曲线结果说明穿心连内酯在质量浓度为为5.0 ～ 22.5μg/mL 范围内有良好的线性关系，得其得其平均载药量为3.92%，包封率为25.01%。依据正交试验的结果，通过极差和F 比分析，探讨了明胶的浓度，搅拌速度，温度三因素对交联乳化法制备穿心莲内酯微球包封率的影响，最终确定了明胶浓度为20%，温度为40℃，搅拌速度2000r/min。发现明胶的用量影响最大，因为明胶作为微球的载体材料，其量的多少对微球的载药量和包封率影响很大。明胶量少，药品包裹不完全，造成浪费，明胶量多，又容易结块，通过实验得出，20%的明胶效果较好。其次是乳化的温度高低对乳液形成影响较大，温度越高不利于乳液形成较稳定的体系，影响微球的成型和载药量，最终确定乳化的温度为40℃。另外搅拌速度对穿心莲内酯微球的粒径与初乳乳滴的大小有密切关系，制备初乳时，搅拌速度不宜过快或过慢，因为低速搅拌粒径会较大，高速搅拌则会产生大量的气泡会降低微球的产量和质量，故制备初乳时宜采用中高速，2000r/min 是制得微球的平均载药量和包封率最佳。穿心连内酯微球制备中，加入交联剂的速度与微球的分散度有很大的关系，过快会出现严重的粘连现象，故应缓慢加入交联剂[14-15]。穿心莲内酯微球的研究未见有报道，本研究为开发穿心莲内酯新剂型提供了思路和参考，也提高了穿心莲植物的药效价值。