TPT对HL—60细胞增殖凋亡作用

刘芳怡　李丽娟

摘 要：目的： 拓扑替康对HL-60白血病细胞增殖凋亡的作用；方法： 应用 MTT光吸收法分别检测0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的TPT分别作用于HL-60细胞后12小时、24小时、36小时、48小时细胞增殖情况，计算增殖抑制率，画出生长曲线反映拓TPT对HL-60白血病细胞增殖作用的影响。结果：采用MTT法检测在同一浓度TPT在不同时间点对HL-60细胞的抑制作用随时间的延长而增强。结论：拓扑替康对HL-60细胞具有增殖抑制作用。

关键词：TPT 细胞增殖 凋亡

中图分类号：R733.7 文献标识码：A 文章编号：1003-9082（2018）06-0-02

拓扑替康（TPT）是一种拓扑异构酶抑制剂，作用位点比较独特，拓扑异构酶是一种细胞核内酶，无多药耐药现象，有较好的选择性特点。急性白血病 （acute leukemia）是一种恶性血液系统疾病，特点是造血干细胞功能大部分丧失，幼稚细胞不断克隆，白血病患者的造血干细胞和正常的造血干细胞存在类似似的特点。白血病是血液系统最常见的恶性肿瘤，近年来发病率越来越高，死亡率也很高，这就严重影响了国民健康。

一、材料与方法

1.材 料

1.1细胞株

人源性白血病细胞系HL-60细胞，由中国协和医科大学肿瘤研究所提供。

1.2实验药物

TPT（注射用盐酸拓扑替康）：四季青有限公司。

2.方法

2.1细胞培养

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2饱和湿度下的恒温箱中进行常规培养，平均2-3天换液一次，细胞生长良好，取倍增期的细胞进行实验。

2.2实验分组

选取生长状态良好、在倍增期的HL-60细胞进行实验分组，共分为两组：对照组和实验组，对照组不加用任何浓度的拓扑替康，实验组分别加用0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L及0.8?mol/L浓度的拓扑替康，选取作用时间为12h、24h、36h和48h。

2.3TPT对HL-60细胞增殖抑制作用的检测

2.3.1TPT作用前后细胞的改变

加入拓扑替康前在倒置显微镜下观察细胞生长状态及特性，并照相；同理加入拓扑替康后也于显微镜下观察HL-60细胞所发生形态变化，并照相。

2.3.2四甲基偶氮唑盐光吸收法

用新鲜配制RPMI1640培养基把细胞配制成单个细胞悬液，在96孔培养板中接种，每孔5×104个细胞200?l量，并设置平行孔。

向实验组中分解加入0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的拓扑替康，在對照组应加入同等量的生理盐水。加药后经过12h、24h、36h、48h分别作用后，每孔加入20?l的MTT溶液，不弃去培养基的条件下，放入37℃和5%CO2孵育箱内孵育4小时，等待检测。将每组每孔细胞均匀轻轻细细吹打，混匀，移入1.5mlEP管中，离心，再在每孔中加入二甲基亚砜150?l，轻轻摇荡10min，使其完全得到溶解。然后将混合液再次置入96孔板中，将96孔板放入酶标仪中，选择波长490nm处，检测各孔的光吸收值，记录结果并把结果打印。根据该结果计算增殖抑制率，抑制率=（1-实验组值/对照组值）×100%来实现的，根据增殖抑制率的结果得出细胞的最适作用浓度和最适作用时间。

二、结果

不同浓度的TPT在不同时间点对HL60细胞生长抑制的MTT结果。

分别采用0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的TPT研究在不同时间点（12h、24h、36h、48h）对HL-60细胞的抑制作用，MTT结果显示各浓度值的抑制细胞增殖作用均随作用时间的延长而增强。

三、讨论

近年来，随着分子诊断学、分子药理学和分子肿瘤学共同的迅猛发展，各种医学技术的提高，也促使在白血病[1]等恶性血液病的治疗方面也已进入到综合治疗时代，体外实验证实，拓扑替康抗肿瘤活性表现在对急性T淋巴母细胞白血病JM细胞株、乳腺癌细胞株[2，3]和动物移植性模型转接肿瘤的治疗方面[4]。

拓扑替康这种新型的抗肿瘤药物，现已广泛推广使用在临床，它的临床作用机制和其它喜树碱药物是相似的，因此具有喜树碱类药物共同的药理作用，它是细胞内一种特异性的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂已被确定。在细胞周期中，拓扑替康于DNA复制前期就特异性地与DNA单链断端上的拓扑异构酶Ⅰ发生特异性结合，阻止了拓扑异构酶Ⅰ修复单链断端，破坏DNA双链结构，最终导致肿瘤细胞死亡。拓扑替康具有广谱抗肿瘤活性[5，6]，在治疗非霍淋巴瘤、肠癌、肺癌和卵巢癌[7，8]等各种恶性肿瘤中，拓扑替康已显示出了有较好的疗效。在白血病细胞中，我们不难发现，拓扑替康靶酶-Topo-Ⅰ要比正常血液细胞中的含量高出来很多，我们还发现，拓扑替康与柔红霉素、氨甲蝶呤、长春新碱等化疗药物[9]没有报道称发生过交叉耐药现象，这就提示我们拓扑替康非常可能在治疗耐药的肿瘤细胞方面显示较好的疗效，这就不难得出结论，也有很多报道证实了拓扑替康在难治性白血病和急性早幼粒白血病的临床治疗方面疗效好，同时疗效佳在治疗急性白血病、骨髓增生异常综合征（MDS）和慢性粒细胞白血病（CMML）等临床治疗方面疗效也有体现[10，11]。也有体外实验证实，拓扑替康抗肿瘤活性表现在对急性T淋巴母细胞白血病JM细胞株、乳腺癌细胞株[12，13]和动物移植性模型转接肿瘤的治疗方面[14，15]。基础研究也表明，拓扑替康对多种移植性鼠、人肿瘤有效，有学者专门对耐药的HT-29人结肠癌细胞株的拓扑替康药物治疗进行了研究，发现拓扑替康竟然能诱导肿瘤变小甚至消退，并且延缓肿瘤生长。另外，在对拓扑替康治疗较敏感的肿瘤中，其持续性服药进行治疗的抗癌活性明显比进行药物冲击性治疗疗效要优越。国内有文献对移植性探鼠体内这种动物模型的卵巢癌细胞进行了详细细致的观察，研究发现当对探鼠进行局部注射拓扑替康后，卵巢癌的肿瘤体积较不进行拓扑替康治疗的肿瘤体积变小，用拓扑替康治疗后的肿瘤进行计算其抑制率的计算，结果可达75%。

本实验检测了利用MTT法得到的对细胞的增殖抑制率，并用抑制率数据绘制出了细胞增殖曲线，通过上述结果发现了拓扑替康对HL-60细胞具有增殖抑制作用。研究发现，化疗药物治疗肿瘤的作用力度是和药物浓度的大小和作用时间的长短不可分开的，浓度较大时间也长的药物抑制肿瘤作用也强，但毒副反应也随之增多，当然抗肿瘤作用也与特定药物性质有密切关系的。本研究通过MTT法探讨了拓扑替康对HL-60细胞的增殖抑制的时间和浓度方面进行了实验。检测所得的数据显示：同一时间点不同浓度的TPT（0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L）对HL-60细胞的抑制作用，随着浓度的升高，拓扑替康的抑制作用显得越来增强。TPT对 HL-60细胞增殖抑制作用，是其促进HL-60细胞凋亡的结果，但TPT诱导HL-60细胞凋亡的具体机制，仍需进一步探讨。

参考文献

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