多肉植物雪国万象叶片诱导组培苗生产体系的建立

轩华强 朱方平 张 伟

（山东省聊城市农业科学研究院，聊城252000）

万象（Haworthia maughanii）是百合科瓦苇属珍稀名种，又名象脚草、毛汉十二卷。万象株高4～8cm，无茎，有粗壮的肉质根，叶肉质圆筒状，成松散莲座状排列，叶顶端截形，大多数呈圆形，“窗”半透明，位于叶顶端的截面处，“窗”面布有白色条纹。万象株型奇特，有很好的观赏性[1]。雪国万象是由日本育种家通过杂交改良繁殖出的万象品种，其特征是大窗和发散状的白纹，具有很高的观赏价值。

因万象自交不亲和，利用种子繁殖比较困难。常规繁殖方法有分株、叶插，但繁殖速度慢，而且对母体的损伤比较大，小苗的成活率也不高[2]，年繁殖率只有1∶3左右，这使得种苗稀缺，另外由于分株、叶插获得的小苗生长较为缓慢，致使供求失衡[3]，行业发展受到限制。采用组织培养的方式能够快速获得大量优质种苗，而且能够保持品种纯度，增加市场竞争力。关于万象组培国内外已有不少报道，但是大都是用花梗作为外植体进行组培，用雪国万象叶片作为外植体进行组培的尚未见报道。

本研究通过对雪国万象的叶片组织培养，寻找最适宜的培养基及各激素水平，以期为部分多肉植物的工厂化生产育苗与品种改良提供理论基础和实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 雪国万象取自山东省聊城市农业科学院生物工程中心一号温室，取长势良好的健康叶片为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒 将洗涤处理好的叶片在超净台上先用75%的酒精快速浸泡30s，用无菌水洗涤2次，再用加有2滴吐温-80的升汞处理8min。然后用无菌水洗涤5次，每次洗涤时间控制在3～4min。消毒后，用消毒镊子和刀片将叶片切成长1cm左右的小块，接种到不同激素配比的诱导培养基上。

1.2.2 愈伤组织诱导 将不同浓度的NAA（萘乙酸）、6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）组合与不同浓度的6-BA、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）组合添加于MS基本培养基（MS+3.0%蔗糖+0.55%琼脂，pH5.86）中进行试验。NAA设置3个浓度，分别是0.10mg/L、0.20mg/L、0.30mg/L；6-BA 设置 3个浓度，分别是 1.50mg/L、2.00mg/L、2.50mg/L；2，4-D 设置3个浓度，分别是0.20mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L。

1.2.3 愈伤组织继代培养 将不同浓度的NAA、6-BA组合添加于MS基本培养基（MS+3.0%蔗糖+0.55%琼脂，pH5.86）中进行试验。NAA设置4个浓度，分别是0.05mg/L、0.10mg/L、0.15mg/L、0.20mg/L；6-BA设置4个浓度，分别是0.50mg/L、1.00mg/L、1.50mg/L、2.00mg/L。

1.2.4 愈伤组织分化 愈伤组织中颜色较绿的部位增殖能力较强[4]，在愈伤组织继代培养中可得到大量愈伤组织，将其绿色较深部位切成小块，接种到诱导不定芽分化的培养基中。分化培养基中添加NAA和6-BA。NAA设置3个浓度，分别是0.05mg/L、0.10mg/L、0.15mg/L；6-BA设置3个浓度，分别是0.50mg/L、1.00mg/L、1.50 mg/L。

1.2.5 生根培养基筛选 当苗长到1.5～2.0cm时，将苗移到生根培养基上进行诱导生根[5]。本试验研究不同浓度NAA和IBA（吲哚丁酸）2种生长素对雪国万象组培苗生根的影响。分别将不同浓度的NAA和IBA添加于1/2 MS基本培养基（1/2 MS+3.0%蔗糖+0.55%琼脂，pH5.86）中进行试验，NAA和IBA均设置7个浓度，分别是0.10mg/L、0.20mg/L、0.30mg/L、0.40mg/L、0.50mg/L、0.60mg/L、0.70mg/L。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对叶片愈伤组织的诱导的影响在叶片诱导愈伤组织培养基中接种灭菌后的叶片，最初叶片会有一定程度的生长，约10d后叶片开始膨大，25d后会有黄绿色的颗粒状愈伤组织在叶片的伤口或者边缘处产生。之后，愈伤组织不断增加，逐渐覆盖整个叶片，30d后统计叶片愈伤组织的诱导情况，结果见表1。

表1 不同浓度NAA、6-BA组合与6-BA、2，4-D组合对叶片愈伤组织诱导的影响

通过表1可以看出，当NAA和6-BA以不同浓度组合时，叶片均能在9种培养基中诱导出愈伤组织，但愈伤组织在生长情况和诱导率方面有明显差异。其中NAA 0.20mg/L+6-BA 2.50mg/L培养基诱导出的愈伤组织长势最好，诱导率也最高，达到98%。该处理愈伤组织颜色为深绿色且排列紧密，有的已经分化出芽。

当6-BA和2，4-D以不同浓度组合时，这9种培养基均能诱导产生愈伤组织，而且可以看出6-BA 2.00mg/L+2，4-D 0.20mg/L培养基的诱导率比其他培养基高。

比较这2种组合，NAA和6-BA配比其愈伤组织诱导率的平均效果明显好于6-BA和2，4-D配比。

2.2 不同浓度的激素配比对叶片愈伤组织继代培养的影响 将诱导出的愈伤组织切成小块转移到继代培养基上进行继代培养，60d后观察不同浓度生长激素组合的培养基中愈伤组织的生长情况，见表2。

表2 不同浓度NAA、6-BA组合对叶片愈伤组织继代培养的影响

从表2中看出，一方面，愈伤组织的增殖率随着NAA浓度的增加，平均增殖率先升高后逐渐减低，在浓度为0.05mg/L时平均增殖率为43.5%，当浓度为0.10mg/L时平均增殖率最高为48.5%，当浓度为0.20mg/L时平均增殖率最低为41.5%；另一方面，愈伤组织的增殖率随着6-BA的浓度从0.50mg/L增加到2.00mg/L，先增加后降低，在浓度为1.00mg/L时，平均增殖率最高为65.5%。结合上述分析，当NAA浓度为0.10mg/L、6-BA浓度为1.00mg/L时，增殖率最高，为愈伤组织最佳的增殖培养基。

2.3 不同浓度的激素配比对愈伤组织分化的影响将诱导出的健康的愈伤组织切成小块，转移到分化培养基上进行培养。经过30d培养后，愈伤组织上先是长出颗粒状浅绿色芽点，之后随培养时间的增加，芽点不断生长，成为不定芽，接着不定芽继续生长，逐渐长成叶片。在不定芽生长过程中，有根从基部长出，不定芽即成长为一株幼苗。再培养30d，不定芽叶腋中长出丛生芽成为丛生苗（表3）。

表3 不同浓度NAA、6-BA组合对愈伤组织分化的影响

由表3可见，在6-BA与NAA配合使用的培养基上，愈伤组织颗粒都有不同程度的分化。以MS基本培养基+NAA 0.15mg/L+6-BA 1.00mg/L培养基上培养的愈伤组织分化效果最好，其分化率达到82%，而且不定芽的长势较好。

2.4 不同浓度的生根激素对不定根诱导的影响选用1/2 MS培养基，当无菌芽增殖形成丛生芽，每株约有2～4个芽，且高度达到1.5～2.0cm时，分别接入不同浓度的NAA和IBA生根培养基中，进行生根诱导试验，结果见表4。

表4 不同浓度NAA和IBA对生根的影响

观察发现，NAA和IBA 2种生长素诱导生根的生根率最高的均是96%，在IBA浓度为0.10mg/L时最低生根率为85%，生根率达到90%的有11个处理。试验表明，当NAA和IBA浓度为0.30～0.50mg/L时，生根率均高于其他浓度。在接种10d后，有些是从接种芽的基部切口处开始长出黄白色的愈伤组织，继而再生出幼根，此外，还有些接种后不产生愈伤组织而直接长出乳白色的幼根，呈鸡爪状，一般在3条以上，多的可达到6～7条。因此表明在NAA或IBA浓度为0.30～0.50mg/L条件下，1/2 MS基本培养基+NAA或者1/2 MS基本培养基+IBA都适宜组培苗生根培养。

3 结论与讨论

3.1 主要结论 （1）适于叶片诱导愈伤组织的培养基是MS基本培养基+NAA 0.20 mg/L+6-BA 2.50mg/L。（2）在对愈伤组织进行继代培养过程中发现，最适培养基为MS基本培养基+NAA 0.10mg/L+6-BA 1.00mg/L。（3）在愈伤组织的分化过程中发现，愈伤组织分化培养的最适培养基为MS基本培养基+NAA 0.15mg/L+6-BA 1.00mg/L，愈伤组织的分化率达82%。（4）适于生根的培养基为1/2 MS基本培养基+NAA 0.30～0.50mg/L或者1/2 MS基本培养基+IBA 0.30～0.50mg/L，生根率达93%及以上。3.2 讨论 （1）愈伤组织的增殖数对愈伤组织的影响。从相关资料（R.M.Gosulsonda 等[6]，K.Kaul等[7]）来看，诱导形成的愈伤组织会在转接到新的培养基上之后继续进行增殖，但这种增殖不是无限进行的，它会在一段时间后停止，甚至会受到损伤，这时就需要将愈伤组织切成小块，继续转接到新鲜的培养基上进行增殖生长，这可能与愈伤组织在增殖过程中分泌的代谢产物有关，这些代谢产物积累之后会影响愈伤组织对营养物质的吸收，甚至会对愈伤组织产生毒害作用，从而使愈伤组织停止增殖，更严重者可能会老化、褐化，甚至死亡。这与本试验中的现象基本上是一致的。（2）在试验过程中，虽然探讨了利用万象叶片在不同激素配比和不同激素浓度下对组培成功率的影响，但是没有探讨温度、光照等环境因素的影响，在以后的研究中，还要继续探讨温度、光照等环境因素对组培过程的影响。