野生金银花高效组培繁殖技术再生研究*

高庆茂,董春燕

(1.莱芜职业技术学院,山东 莱芜271100;2.青州市亚泰农业有限公司,山东 青州262501)

金银花 (Lonicera japonica Thunb.)又名过冬藤、金花和银华等,是忍冬科 (Caprifoliaceae)常绿多年生藤本植物,野生种分布较为广泛,常见生于林中、山坡灌丛和道路两边[1]。金银花是重要的传统中药材,其藤、茎、叶、花蕾均可入药,具有清热解毒、抑菌消炎、止血、抗老化等功效,药用价值较高[2]。同时,金银花的花清香怡人,既可用作园林绿化又可作盆景,是一种珍贵的观赏植物[3]。传统的金银花繁殖方式主要有压条、扦插、分株、嫁接和种子繁殖等,不仅育苗周期长、繁殖率低、易感病菌[4],还易使金银花生长不良,药用有效成分积累减少,造成产品品质的下降。加之,野生金银花繁殖速度慢,而从野外大量取材又易对生物资源及生态环境造成破坏,因此不易大量获得栽培种苗。组培快繁不仅能够保持亲本的优良性状,还具有较高的繁殖系数,并能够排除外界环境的干扰进行周年生产。当前,国内外虽有金银花组织培养方面的研究报道,如山东平邑县的红河金银花和沂蒙山区特有的凤爪金银花其地域性较强,品种上也存在差异[5-6]。另外,前人关于金银花组培的研究,在外植体选材上多以茎尖、叶片、芽进行组织培养,而本试验选取的是植株茎段作外植体,这与前人在取材上存在不同。同时,本试验外植体选取的是当年生枝条,有研究报道选择2年生枝条做供试材料,在选材上虽然均是植株枝条,但是生长年龄存在不同。在灭菌消毒、不定芽诱导、继代增殖和生根诱导等方面所采用的方法与前人亦存在不同,其目的是探索新的组培快繁途径,为金银花的快速繁育提供新技术。总之,本试验通过组织培养的方式研究不同激素组合及浓度配比对野生金银花茎段灭菌消毒、不定芽诱导、继代增殖和生根诱导的影响,以期在保持亲本特性的基础上提高繁殖速度和繁殖系数,实现金银花工厂化育苗,促进金银花产业的快速发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料取自连云港师范高等专科学校试验基地,试验以野生金银花当年生茎段为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 样品预处理

2017年4月10日上午,在大田取金银花当年生健壮幼嫩枝条,剪去叶片,浸泡于含少量洗衣粉的溶液中10min,流水下冲洗20min,用无菌滤纸吸干表面水分,剪成1.5-2.0cm长的带对生腋芽的幼嫩茎段备用。

1.2.2 外植体灭菌消毒方法试验

试验设置6个处理,每处理10瓶,每瓶接种5个外植体,每处理重复3次,接种完成后统一放置在人工智能气候箱中进行培养。14d后查看并记录污染数、死亡数和无菌苗数。

接种所用培养基为:MS+6-BA 0.4mg/L+NAA 1.6mg/L+2,4-D 0.2mg/L,pH5.8-6.0。75%碱化乙醇配制方法为:100份体积分数75%的乙醇+1份质量分数40%的NaOH溶液。

1.2.3 不定芽诱导试验

试验设置9个处理,每处理10瓶,每瓶接种5个外植体茎段,每处理重复3次,接种完成后统一放置在人工智能气候箱中进行培养。接种所用培养基为MS培养基,pH5.8-6.0。15d后查看并记录出芽外植体数。

1.2.4 增殖培养试验

将长势基本一致的不定芽从基部切下,接种于添加不同激素和浓度组合的MS培养基上进行继代增殖培养,试验设置6个6-BA、NAA组合,每处理接种30瓶,每瓶接种3个芽,10瓶为1个重复,每处理3次重复,接种完成后统一放置在人工智能气候箱中进行培养。接种所用培养基为MS培养基,pH5.8-6.0。28d后观察记录不同激素组合及浓度配比对不定芽继代增殖的影响,记录增殖数并计算增殖系数。

1.2.5 生根诱导试验

将长势基本一致、高约2cm的丛生芽从基部切下,转接于添加不同激素和浓度组合的1/2MS培养基上进行生根诱导试验,试验设置6个IBA、NAA组合,每处理接种30瓶,每瓶接种3个幼苗,10瓶为1个重复,每处理3次重复,转接完成后统一放置在人工智能气候箱中进行培养。转接所用培养基为1/2MS培养基,pH5.8-6.0。30d后观察记录不同激素组合及浓度配比对金银花无菌苗生根状况的影响,记录生根苗数、计算生根率、测定根长。

以上4个试验的培养条件为,温度24-26℃,湿度60%-65%,光强2 000Lx,光照时间12h/d。

1.3 数据统计分析

采用DPS 7.02统计软件和Microsoft excel 2003软件对数据进行统计分析。

污染率 (%)=染菌的外植体数/接种外植体数×100;死亡率 (%)=死亡的外植体数/接种外植体数×100;无菌苗率 (%)=无菌出苗的外植体数/接种外植体数×100。增殖数=组培瓶内有效苗数;增殖系数=增殖数/接种苗数。生根苗数=单个重复生根苗数;生根率=单个重复生根苗数/单个重复转接苗数。

2 结果与分析

2.1 不同消毒灭菌方法对外植体污染率、死亡率及无菌苗率的影响

由表1可知,不同消毒方法对金银花外植体污染率、死亡率及无菌苗率的影响存在差异。A1、A2、A3处理在75%无水乙醇消毒30s条件下,随0.1%升汞处理时间的增加,金银花外植体污染率表现出下降趋势,死亡率表现出上升趋势,而无菌苗率表现出先升高后降低的趋势,表明升汞处理时间增加虽能降低外植体污染率,但却增加了其死亡率,所以并非0.1%升汞消毒时间越久越好;A4、A5、A6处理在75%碱化乙醇消毒30s条件下,随0.1%升汞处理时间的增加,金银花外植体污染率、死亡率和无菌苗率表现出与前者类似的规律,但在0.1%升汞处理时间相同时,使用75%碱化乙醇消毒的处理其污染率和死亡率均对应低于用75%乙醇消毒的处理,如A4处理的污染率和死亡率对应低于A1处理。另外,A2、A5处理在外植体无菌苗率上差异达显著水平 (P＜0.05),而它们与其他处理间差异均达到极显著水平 (P＜0.01),无菌苗率极显著高于其他处理,分别为76.67%和82.67%,说明这两个处理下外植体消毒效果较好,但无菌苗率以A5处理下最高。综合考虑,外植体最佳消毒灭菌方法为75%碱化乙醇+0.1%升汞消毒12min。

表1 不同消毒灭菌方法对外植体污染率、死亡率及无菌苗率的影响Tab.1 Effects of different disinfection and sterilization methods on explant contamination rate,mortality rate and aseptic seedling rate

2.2 不同6-BA和NAA浓度及配比对金银花外植体不定芽诱导的影响

由表2可知,在NAA浓度一定时,6-BA对不定芽诱导表现出低浓度促进,高浓度抑制;而6-BA浓度一定时 (NAA 0.6mg/L除外),NAA对不定芽诱导的影响也表现出类似规律。

表2 不同6-BA和NAA浓度及配比对金银花外植体不定芽诱导的影响Tab.2 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on the induction of adventitious buds in explants of Lonicera japonica Thunb.

由表2可知,6-BA浓度0.5mg/L的 B1、B4和B7处理下,不定芽发生个数最少,且生长都相对细弱。6-BA浓度2.5mg/L的B3、B6和B9处理下,不定芽发生数为2-4个,但不定芽较矮且生长慢。6-BA浓度1.5mg/L的 B2、B5和 B8处理下,不定芽发生个数3-6个,不定芽生长快。另外,在6-BA 1.5mg/L+NAA 0.12mg/L的B5处理下,出芽外植体数量和不定芽诱导率分别为44.33和88.67%,与其他处理达到极显著差异水平 (P＜0.01),不定芽发生数最多,达到4-5个,且生长健壮、生长速度快。因此,金银花外植体不定芽诱导最佳培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.12mg/L。

2.3 不同激素组合及浓度配比对金银花不定芽继代增殖的影响

由表3可知,不同激素组合及浓度配比对金银花不定芽继代增殖的影响差异显著。其中,含有6-BA的C1和C2处理增殖数和增殖系数较大,与其他处理间的差异均达到极显著水平 (P＜0.01),其次是含有ZT的C5和C6处理,而含有KT的C3和C4处理较小,由此可知,6-BA较ZT和KT更有利于金银花不定芽的继代增殖,增殖效果最佳。在6-BA、KT或ZT相同而NAA浓度不同条件下,NAA浓度0.02mg/L较0.08mg/L更有利于增殖数和增殖系数的增加、不定芽的生长、增粗和分化,如C1处理较C2处理生长快、分化好,C1不定芽增高约3.8cm,高于C2的1.4cm,C3与C4、C5与C6表现出类似的规律,这说明NAA浓度并非越高越好,超过一定的限度反而不利于金银花不定芽的生长并使其分化减缓。总之,C1处理下增殖数和增殖系数均最大,分别为123.33和4.11,且接种的不定芽生长快、分化好,所以金银花继代增殖最佳培养基配方为C1处理下的配方,即MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.02mg/L。

表3 不同激素组合及浓度配比对金银花不定芽继代增殖的影响Tab.3 Effects of different hormone combinations and concentration ratios on subculture of adventitious buds of Lonicera japonica Thunb.

2.4 不同浓度激素配比对金银花无菌苗生根诱导的影响

接种7-10d,不同处理的植株陆续有不定根分化,16-20d各处理不定根逐渐发生。由表4可以看出,在金银花无菌苗接种30d后,各处理均有不定根长出,但处理间生根苗数、出苗率、根长和根系生长状况存在差异。在IBA浓度1.5-3.5mg/L范围内,金银花生根苗数、出苗率、根长表现出类似的规律,均随其浓度的增加呈现先升高再降低的趋势,并以IBA浓度2.5mg/L时上述指标最佳。

表4 不同浓度激素配比对金银花无菌苗生根诱导的影响Tab.4 Effects of different concentrations of hormones on rooting induction of aseptic seedling of Lonicera japonica Thunb.

由表4可知,在IBA浓度相同时,金银花生根苗数、出苗率、根长的表现在NAA浓度0.6mg/L时好于 0.2mg/L时。D5(IBA 2.5mg/L+NAA 0.6mg/L)处理下,金银花生根苗数、出苗率、根长分别为 27.67个、92.2%和 3.27cm,与 D1、D3、D4差异水平达到极显著 (P＜0.01),与D2、D6差异不明显;生长状况,以D1、D4处理生根慢,D3、D6处理虽然生根快,但根系细弱且有愈伤组织出现,D2和D5处理根系生长快且根系健壮。所以,金银花无菌苗生根诱导培养基配方以1/2MS+IBA 2.5mg/L+NAA 0.2-0.6mg/L较好。

3 结论与讨论

以野生金银花当年生茎段为外植体,MS和1/2 MS作基本培养基,研究不同激素对金银花外植体灭菌消毒效果、不定芽诱导、增殖培养和组培苗生根诱导的影响,以建立野生金银花高效快繁体系。结果表明:外植体最佳消毒灭菌方法为75%碱化乙醇+0.1%升汞消毒12min,外植体无菌苗率达到82.67%;不定芽诱导最佳培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.12mg/L,不定芽诱导率为88.67%;继代增殖最佳培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.02mg/L,增殖倍数达到4.11,与其他处理差异达到极显著水平 (P＜0.01);生根诱导培养基配方以1/2MS+IBA 2.5mg/L+NAA 0.2-0.6mg/L较好,生根率和根长分别达到85.56%-92.22%和3.14-3.27cm。

金银花外植体无菌材料的获得是其进行组培快繁的前提条件,但由于其枝条表面生有疏腺毛和疏柔毛,内部中空[7],常规消毒方法难以有效杀灭病菌。本试验条件下,0.1%升汞处理12min对当年生茎段的灭菌效果好且无菌苗率最高,而处理时间5min和19min效果均不理想。李翔等[8]在对华南忍冬 (Lonicera confusa)组织培养的无菌研究时指出,金银花腋芽用75%酒精处理25s+0.1%升汞处理9min和带腋芽的茎段用75%酒精处理30s均能取得较好的灭菌效果,与本试验条件下升汞处理时间不同,这可能是因为品种的不同、处理时间的长短等对试验结果的影响存在差异。本研究还得出,在0.1%升汞处理时间相同前提下,75%碱化乙醇对金银花外植体表明灭菌效果优于75%乙醇,这可能是因为碱化乙醇中所含的OH-能改变细胞表面所带电荷的性质,进而改变膜的通透性[9],使其杀菌效果较75%乙醇更为理想。总之,本试验研究表明,当年生茎段作外植体,采用75%碱化乙醇+0.1%升汞消毒12min进行消毒,可使用外植体无菌苗率达到82.67%,效果较好。

6-BA有利于芽的分化并能促进侧芽萌发生长[10],NAA在低浓度下能够促进细胞生长,而高浓度下促使细胞成熟衰老[11]。杨冬业等[12]通过在培养基中添加6-BA和IBA两种激素进行不定芽诱导研究,指出以 MS作基本培养基,添加6-BA 2.0mg/L+IBA0.01-0.05mg/L适合不定芽的诱导。本试验条件下,以金银花茎段作外植体,采用MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.12mg/L的方法使不定芽诱导效果最佳。6-BA浓度过低、过高均不利于金银花不定芽的发生,NAA在低浓度下能够促进芽的生长,而在高浓度下作用与之相反,可见只有生长素和细胞分裂素在一定浓度时才能较好地诱导金银花不定芽的发生。

IBA是试管苗生根试验中最为常用的生根剂之一[11],其浓度过低过高均不利于组培苗生根,当浓度过低时对组培苗生根诱导的促进作用不明显,过高时会诱导出大量的愈伤组织从而降低生根率[13],因此只有适宜浓度的IBA才有利于试管苗的生根。本试验条件下,金银花无菌苗生根诱导培养基配方以1/2MS+IBA 2.5mg/L+NAA 0.2-0.6mg/L较好,而当IBA浓度达到3.5mg/L时D3和D6两个处理组培苗均出现了愈伤组织,而愈伤组织的出现将严重影响金银花室外移栽成活率[14],因此D6处理下的培养基配方不适于生根诱导。赵贤惠[15]在以红金银花顶芽为外植体进行组培快繁研究时指出,生根培养以1/2MS+6-BA 0.25mg/L+NAA 1.0mg/L+活性炭1.0g/L可得到理想的生根苗。李永兴等[16]研究认为,以 1/2MS+NAA 1.50mg/L作培养基,金银花灰毡毛忍冬组培苗生根效果最好,前人研究结论与本试验结果不一致,这可能是因为研究所用的品种及组培所用植株部位不同造成试验结果的差异。