鸡源致病性奇异变形杆菌分离鉴定及药敏试验

何欣怡，徐 睿，任 丽，唐 强

（西昌学院动物科学院，四川 西昌 615000）

奇异变形杆菌为革兰氏阴性菌，无芽胞、无荚膜、周身鞭毛、形态成明显多形性，其生长繁殖对营养要求不高，4～7℃即可繁殖。该菌广泛存在于人与动物粪便、污水、土壤及临床标本中，其产生的毒素可以引起中毒，是一种常见的条件致病菌。奇异变形杆菌不仅感染鸡、鸽、山羊、奶牛和猪等常见家畜，也可感染猴、狐狸、熊猫和水貂等动物，在动物机体体抗力下降时能够引起外科感染、泌尿系统感染、腹泻和菌血症等[1-8]。近年来，我国河南、河北、山东、安徽、广西等地不断有鸡群暴发奇异变形杆菌病，尤其是在季节更替、环境变化、转群和混合感染其他病原时，鸡群体抗力下降，病情加重，病死率升高，给畜禽养殖带来较大的经济损失[9-10]。

本试验通过对西昌市月华乡、兴胜乡、太和镇、德昌县王所乡鸡场样品进行奇异变形杆菌的分离鉴定、药敏试验和致病力试验，证明该病原菌为奇异变形杆菌，且筛选出敏感药物，为污染控制、疾病防治提供了试验依据。

1 试验材料

1.1 主要试剂 营养肉汤、营养琼脂均购置于青岛高科园海博生物技术有限公司；麦康凯琼脂培养基、水解酪蛋白琼脂、药敏纸片均购置于杭州微生物试剂有限公司；DL 2000 DNA Marker、2×Tap PCR Master Mix、细菌基因组DNA提取试剂盒均购置于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 主要仪器 超净工作台（苏州净化设备有限公司）、基因扩增仪（珠海黑马医学仪器有限公司）、DYY-6C型电泳仪电源（北京市六一仪器厂）、水平电泳槽（北京市六一仪器厂）、切胶仪（天根生化科技（北京）有限公司）等。

1.3 试验动物3日龄健康雏鸡100只。

2 试验方法

2.1 病料的采集 在西昌市月华乡、兴胜乡、太和镇、德昌县王所乡鸡场对疑似奇异变形杆菌病的死鸡进行病理解剖，观察其内部器官，并对其出现病变的部位如肝脏、肠道、脾脏等器官进行病料采集，带回实验室备用。

2.2 细菌的分离培养 在无菌的条件下，将病变组织新鲜切面触压于普通营养琼脂平板，37℃恒温恒湿培养16～18 h，挑选单个典型菌落进行革兰氏染色及镜检。然后再将其接种于麦康凯琼脂平板，伊红美蓝琼脂平板，血平板，37℃培养16～18 h，观察菌落在平板上的生长情况及溶血特征，挑取单个典型菌落进行革兰氏染色后镜检，同时挑取单个菌落接种于营养肉汤培养基37℃180 r/min，震荡培养16～18 h，4℃存放备用。

2.3 分子生物学鉴定

2.3.1 引物设计 通过GenBank中已发表的序列，奇异变形杆菌16S rRNA通用引物。上游引物B27-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游引物B-1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT，由上海杰李生物技术有限公司合成。

2.3.2 细菌DNA的制备 按照细菌基因组DNA试剂盒的步骤对纯化细菌进行DNA提取。细菌DNA于-20℃存放。

2.3.3 16S rRNA核苷酸序列扩增PCR 25 μL反应体系：上游引物B27-F：0.5 μL，下游引物B-1492R：0.5 μL，2×Tap PCR Master Mix：12.5 μL，ddH2O：9.5 μL，模板DNA：2 μL。

PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸50 s，35个循环；72℃延伸5 min。反应产物-20℃存放。

2.3.4 琼脂糖凝胶电泳16S rRNA核苷酸序列扩增完成后，取10 μL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并置于SDS-PAGE凝胶成像系统成像，观察条带的亮度及初略大小，切下琼脂糖凝胶中目的条带，送往上海杰李生物技术有限公司测序。

2.3.5 序列分析 测序后，利用NCBI网站中Blast检索系统对测序得到的16S rRNA基因序列进行同源性分析，确定菌株的类型。

2.4 药敏试验 使用kirby-bauer（K-B）纸片法进行试验，然后根据美国临床标准委员会（NCCLS）标准将其分为敏感（S）、中介（I）、耐药（R）。

2.5 雏鸡致病力试验 将100只3日龄的健康雏鸡随机分成20组，每组5只。1～18组为试验组，19组为试验对照组，20组为空白对照组，试验组菌液用灭菌肉汤稀释到浑浊度与1.0个麦氏单位浑浊度一致（菌液浓度约为3×108cfu/mL），具体处理方案（如表1）处理后，每隔12 h观察并记录1次雏鸡的精神状况及死亡情况，并对死亡雏鸡进行病理解剖，无菌采集心脏、脾脏、肝脏等病变器官及组织，然后分离培养及鉴定，完成菌株的回收。

表1 处理方案Table 1 Plan to deal with

3 结果与分析

3.1 细菌的分离培养 营养琼脂上形成乳白色中等大小菌落，菌落边缘整齐，有明显迁徙生长现象，散发特殊的腐败性气味；麦康凯琼脂形成淡红色圆形扁平菌落，表面光滑湿润；鲜血平板上呈无色菌落。镜检结果为的革兰氏阴性细菌，以杆状为主，菌体多两端钝圆。详见图1～4。

3.2 分子学鉴定结果 经16S rRNA基因PCR扩增后，用SDS-PAGE凝胶成像系统成像，扩增得到的相应目的条带在1 000～2 000 bp之间，与预期条带大小初略一致，详见图5。经上海杰李生物技术有限公司测序后，利用NCBI网站中Blast检索系统对测序得到的16S rRNA基因序列进行同源性分析，结果表明扩增序列与GenBank上其他奇异变形杆菌的核苷酸同源性达到99%以上。

图1 营养琼脂平板Fig.1 General Nutrition Tablets

图2 麦康凯平板Fig.2 MacConkey Tablet

图3 鲜血平板Fig.3 Blood plate

图4 镜检Fig.4 Microscope inspection

3.3 药敏试验 随机挑选3个不同养殖场共7株奇异变形杆菌对头孢类、青霉素类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、大环内酯类及四环素类共6种类型抗生素进行药敏试验。根据美国临床标准委员会（NCCLS）标准将其分为敏感（S）、中介（I）、耐药（R）。药敏具体情况见表2。

图5 16S rRNA电泳图Fig.5 Electropherogram of 16S rRNA

表2 奇异变形杆菌药敏试验结果Table 2 Results of drug test of Proteusmirabilis

试验数据表明：7株奇异变形杆菌对头孢一代药物的耐药率为71.4%；对头孢二代药物的耐药率为71.4%；对头孢三代药物的耐药率为14.2%～71.4%；对青霉素类药物的耐药率为14.2%～85.0%；对氨基糖苷类药物的耐药率为0.00%～42.8%；对氟喹诺酮类药物的耐药率为28.5%；对大环内酯类、四环素类药物的耐药率为100%。

3.4 雏鸡致病力试验 试验组雏鸡，先后表现不同程度的精神萎靡，食欲减退，羽毛蓬乱，站立不稳，且喜卧，并且少数雏鸡死亡后还出现角弓反张（见图5）等精神症状。试验组的雏鸡在12 h左右陆续出现死亡，死亡情况详见表2。试验对照组和空白对照组雏鸡精神状况良好。将死亡的雏鸡进行病理解剖，发现主要病变有：脾脏、肾脏有不同程度的肿大；胸腺有出血点（见图6）；胆囊肿大充盈；肝缘有淤血（见图7）；脑膜有出血、充血（见图8）。在无菌条件下，将死亡雏鸡病变器官和组织用涂抹的方式接种于普通琼脂平板上，分离纯化、鉴定，回收到的菌株与注射的菌株一致。

图 5 角弓反张Fig.5 Antagonist

图 6 胸腺肿大Fig.6 Thymus enlargement

表 3 奇异变形杆菌的致病力试验结果Table 3 Results of pathogenicity test of Proteusmirabilis

图 7 肝脏淤血Fig.7 Hepatic congestion

图 8 脑膜出血Fig.8 Meningeal Hemorrhage

4 讨论

致病力试验结果表明，18株奇异变形杆菌中有16株具有致死性，其中致死率高于60%有5株，有4株的致死率为40%，有7株的致死率为20%。奇异变形杆菌为条件致病菌，当其与宿主间的生态平衡在某些情况下被打破，就会形成生态失调，从而正常不致病的正常菌群就成为条件致病菌。细菌的寄生部位发生改变、机体免疫功能下降、菌群失调[11]都有可能打破这种平衡，从而导致疾病的发生。

药敏试验结果显示，7株奇异变形杆菌都出现多重耐药性，但因不同地区养殖场使用抗生素情况不同，其耐药情况不完全一致。从总体上看，7株奇异变形杆菌都出现了严重的耐药性，表现为同时对红霉素、麦迪霉素、多西环素、米诺环素共4种抗生素耐药，其中红霉素、麦迪霉素、多西环素的抑菌圈直径均为0。头孢类药物的耐药率为14.2%～71.4%，明显高于年华等[12]相同药物5.4%～59.0%的耐药率，可能由本地区用药情况及耐药菌株的不断衍化造成。丁胺卡那在试验中表现出高敏性，可作为治疗该地区奇异变形杆菌病的首选药物。

结合各采样场实际情况，造成细菌多重耐药的主要原因可能有以下几点：①养殖场为了提高动物性能、改善饲料转化率、预防疾病而在饲料中添加大剂量的抗生素；②在治疗过程中盲目使用抗生素，或使用抗生素治疗不彻底。

临床上，应加大对畜禽舍消毒强度，并提高畜禽自身免疫力；在使用抗生素时，应严格掌握抗菌药物的类型、剂量、给药次数、给药途径、疗程、联合用药及交叉用药，避免出现超剂量使用、长期低剂量使用及无针对性用药等滥用抗生素的现象。有条件最好先进行药敏试验，筛选出敏感药物再进行治疗。