奶牛乳房炎源性产色葡萄球菌的肠毒素基因检测

赵华男,瞿 玥,韩 博,李树梅,高 健

(1.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193;2.西北农林科技大学动物医学院,陕西 杨凌 712100;3.北京实验动物研究中心,北京 朝阳 100012)

奶牛乳房炎是造成奶牛养殖业经济损失最主要的疾病之一,主要由细菌感染引起。近年来的流行病学结果显示,凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)已经成为引起奶牛乳房炎的主要致病菌之一[1]。而乳房炎源性CNS中,产色葡萄球菌的分离率最高[2]。肠毒素是引起牛奶葡萄球菌食物中毒的主要致病因子,由一组结构相关、毒力相似、抗原性不同的细胞外蛋白组成。肠毒素具有多个基因型,除sea、seb、sec、sed和see等5 种传统基因型外,近年来还发现了seg、seh、sei、sej等新型肠毒素基因型[3-4]。研究表明,葡萄球菌可产生黏液,生物被膜和黏液的形成有助于细菌逃避宿主的免疫防御和抗生素杀灭,葡萄球菌可以携带负责产生黏液的ica操纵子[5-6]。近年来研究发现,bap也是介导葡萄球菌产生生物被膜的一种重要基因[7]。本试验旨在对我国奶牛乳房炎源性产色葡萄球菌肠毒素基因分布及生物被膜产生状况进行探查,从而为原料奶的安全生产及乳房炎治疗的用药提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 培养基与试剂 胰酪大豆胨琼脂(TSA)、LB肉汤、刚果红琼脂、甘露醇氯化钠琼脂,购自北京奥博星生物技术责任有限公司;脑心浸液琼脂,购自北京陆桥生物技术有限责任公司;细菌基因组DNA提取试剂盒及PCR Master Mix,购自北京华泰博奥生物科技有限公司;DL-2 000 DNA Marker,购自北京拓英时代科技有限公司。

1.2 产色葡萄球菌的分离及鉴定 2014年至2016年间,对国内21个省份161个大型规模化奶牛的3 288份临床乳房炎样品进行无菌采集及致病菌鉴定[8]。产生葡萄球菌鉴定程序如下：将100 μL奶均匀涂布至TSA平板,置37℃恒温培养箱培养24 h,挑选生长的菌落接种于新TSA平板进行纯化培养24 h。挑选单菌落革兰染色镜检,筛选出革兰阳性球菌进行触酶试验。触酶试验阳性细菌进行凝固酶试验。凝固酶试验阴性的细菌接种于高盐甘露醇琼脂平板,37℃恒温培养24 h后,挑取单菌落至LB肉汤增菌培养18 h,提取细菌全基因组DNA。参照Lange等使用的引物和反应条件进行16S rDNA基因的PCR扩增[9]。将扩增条带进行纯化及测序后,与NCBI数据库中的基因序列进行比对,按照99%以上的序列相似性标准进行产色葡萄球菌的种鉴定。鉴定后的细菌保存于-80℃,DNA样品保存于-20℃。

1.3 生物被膜产生能力检测 将产色葡萄球菌接种于刚果红琼脂上,37℃培养24 h,常温放置48 h,观察生长菌落特征,能够产生生物被膜的细菌在刚果红琼脂上形成黑色菌落,不产生物被膜的产色葡萄球菌形成红色菌落[6,10]。

1.4 肠毒素基因及生物被膜相关调控基因检测根据Otsuka等和Cucarella等所用引物序列及PCR扩增条件[11-12],对icaA、icaD和bap等生物被膜相关调控基因进行检测。根据Xu Jia等和Martins等所用引物序列及PCR反应条件[13-14],对sea、seb、sec、sed、see、seg、sei、sej和seh等肠毒素基因进行检测。所有引物序列、退火温度及扩增片段长度见表1。PCR体系包括 DNA模板1 μL,TaqMaster Mix 12.5 μL,上下游引物各 0.5 μL,ddH2O 10.5 μL。取PCR扩增产物10 μL,1.2%琼脂糖凝胶电泳进行扩增产物分析。

表1 引物名称、序列、退火温度及扩增产物长度

2 结果

2.1 产色葡萄球菌鉴定 用微生物培养法鉴定出112株CNS,来源于18个省份的59个奶牛场。CNS在血平板上菌落呈中等大小的白色或淡黄色菌落,伴或不伴溶血;所有细菌革兰染色镜检呈现葡萄状阳性球菌,触酶阳性,凝固酶阴性;高盐甘露醇平板上均能生长,菌落呈粉红色或黄色。所有CNS(n=112)均能扩增出536 bp大小的PCR产物(图1)。将PCR产物与NCBI中的已知序列进行BLAST比对,36株CNS最终鉴定为产色葡萄球菌,来源于11个省份的20个奶牛场。

2.2 肠毒素基因检测 在36株产色葡萄球菌中,有33株携带至少一种肠毒素基因,占比92%;有18株细菌携带两种及以上肠毒素基因,占比50%。在各型肠毒素基因中,sea、sec、seg、sei和seh基因检出率分别为 36%、25%、8%、47% 和 50%(表 2)。Seb、sed、see和sej基因在产色葡萄球菌中未检出。在18株携带两种以上肠毒素基因的细菌中,有7株同时携带sei+seh基因,各1株分别携带sea+sec基因和sea+seh基因,3株同时携带sea+sec+sei基因,2株携带sec+seg+sei基因,2株携带sea+sei+seh基因,2株携带sec+sei+seh基因。

2.3 生物被膜检测 在36株产色葡萄球菌中,29株能产生生物被膜,在刚果红平板上呈灰黑色菌落生长,阳性率为81%;7株不产生物被膜,呈红色菌落生长。在所有细菌中,3株(8%)含有icaA基因,19株(53%)携带icaD基因,bap基因未检出(表3)。在29株产生物被膜菌株中,19株携带icaA或icaD基因,敏感性为66%。7株不产生物被膜的菌株中,6株不携带icaA或icaD基因,特异性为86%。

表3 产色葡萄球菌(n=36)生物被膜及相关基因检测结果

3 讨论

本试验对来自国内18个省份的59个规模化奶牛场中112株CNS进行测序鉴定,显示产色葡萄球菌在其中占比最高(33%)。来自不同国家的很多报道显示,产色葡萄球菌是最常见的一种乳房炎源性[13,15-16],与本试验结果相符。葡萄球菌肠毒素是一种热稳定蛋白质,能够抵抗胃液中蛋白水解酶的作用并非特异性激活T细胞,释放过量的细胞因子(TNF-α、IL-1、IFN-γ等)而致病。本试验中92%产色葡萄球菌携带肠毒素基因,且有一半的菌株携带多种肠毒素基因。在本试验中,肠毒素基因的检出率高于国内其他报道结果[13],与国外的报道较为接近[14,17]。 本试验中,sei、seh、sea和sec等肠毒素基因的检出率很高,与先前报道(seb检出率很高,sea检出率不足2%)具有较大差异[17]。以上结果表明,可能存在其他类型肠毒素基因而本试验并未进行检测。此外,奶牛乳房炎源性葡萄球菌肠毒素基因的流行可能存在地域相关性,为这些地区的原料奶生产带来较大的安全隐患。因此,建立一个规范的奶牛乳房炎源性葡萄球菌及其肠毒素检测体系非常必要。

作为一种重要毒力因子,生物被膜的形成使得CNS能够抵抗机体免疫系统及抗生素的杀灭作用。研究表明,icaA/B/C/D构成一个操纵子,编码形成N-乙酰葡糖胺转移酶,进一步合成多糖胞间粘附素(PIA),而PIA为细菌生物被膜形成所必需[14]。而在ica基因阴性的葡萄球菌中,也可通过细菌表面蛋白(如bap蛋白)直接作用而形成蛋白依赖的细菌膜[5,14]。本试验在36株产色葡萄球菌中,29株产生生物被膜,表型阳性率高达80.6%。本试验中,产色葡萄球菌生物被膜相关调控基因icaA/D的检出率与国内先前报道相似[5],高于国内外其他一些报道[13-14,18]。本试验中产色葡萄球菌均不含有bap基因,与国外报道结果一致[10,18],但明显低于国内另一报道[13]。进一步分析得出,携带较多生物被膜相关调控基因的菌株来自河北、内蒙古和黑龙江,而来源于北京的菌株携带率较低,说明产生物被膜菌株的流行有一定地域性。在29株产生物被膜菌株中,仅有19株携带icaA或icaD基因,提示可能存在其他机制参与生物被膜的形成过程,而其作用尚未阐明,需要对细菌的生物被膜产生机制进行进一步的探索和研究。在7株不产生物被膜的菌株中,有1株携带icaD基因,表明部分携带生物被膜的基因的菌株并未表现出阳性表型,可能需要特殊的环境诱使其进行表达。

综上所述,作为奶牛乳房炎奶样中分离比例最高的一种CNS,产色葡萄球菌中肠毒素基因的检出率很高,以sei、seh、sea和sec为主。 同时,大多数产色葡萄球菌能够产生生物被膜,icaD基因的检出率最高。本试验首次对乳房炎源性产色葡萄球菌的毒力特征进行报道,可为制定原料奶的安全生产措施及有效的乳房炎治疗方案提供理论基础。