罗布麻中黄酮的超临界CO2萃取及其抗菌性

2018-08-23高世会郁崇文

纺织学报 2018年8期

高世会，郁崇文

(1. 辽宁轻工职业学院，辽宁大连 116100； 2. 东华大学纺织学院，上海 201620)

自然界中大部分绿色植物中都含有黄酮，其含量很高，结构由3部分组成，可用C6—C3—C6表示，即由1个中央三碳链C3连接2个苯环，组成黄酮的基本分子结构。这个C3桥连部分可以直线形式与2个苯环相连，也可与其中的1个苯环和氧结合成为复杂的杂环。根据中央三碳链的结构，可将黄酮类化合物分为黄酮类、异黄酮、黄酮醇类以及各类二氢衍生物[1]。另外2个苯环上一般都有取代基，不同的取代基可形成不同种类的黄酮类化合物，赋予其不同的功能，对生物的药理作用主要表现在：可预防氧化[2]，延缓疲劳和衰老[3]；对循环系统疾病[4]和癌症肿瘤[5]有一定治疗作用；在日常生活中还可用于抗菌等[6-7]。

黄酮在罗布麻韧皮中也有较高的含量，但在传统的脱胶工艺中：天然水沤麻脱胶不彻底，周期长；化学法脱胶易损伤纤维性能和光泽，且污染环境；微生物脱胶质量不稳定。此外在这些脱胶方法中，罗布麻韧皮中黄酮资源并没有得到充分的利用[8-9]，其黄酮类物质大都随着脱胶产物排放到脱胶废液中，浪费了宝贵的黄酮资源。为此，本文利用超临界CO2对罗布麻韧皮中的黄酮进行提取，并对罗布麻原麻、超临界萃取黄酮后的罗布麻以及提取的黄酮进行了液相色谱分离与检测，进而测定了罗布麻及其萃取液的抗菌活性，分析罗布麻纤维的抗菌机制。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

材料：当年生长的新疆罗布麻，通过手工剥离韧皮部分(纤维素含量为 42%～48%)，罗布麻纤维采用传统化学方法脱胶，残胶率为4%～6%。

试剂：乙醇(CH3CH2OH)、甲醇(CH3OH)、磷酸(H3PO4)、三氯化铝(AlCl3)，天津市科密欧化学试剂有限公司；芦丁(C27H30O16)、槲皮素(C15H10O7)，中国药品生物制品检定所；山柰酚(C15H10O6)，南京泽朗医药科技有限公司；二氧化碳(纯度99.99%)，中昊光明化工研究设计院有限公司；去离子水，实验室自制。

仪器：超临界CO2萃取反应设备，大连工业大学；UV-8000型紫外-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；AL204型电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；EC2003型高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司。

1.2 罗布麻黄酮乙醇提取工艺

利用质量分数为70%的乙醇水溶液对罗布麻黄酮进行提取。首先精确称量罗布麻韧皮、罗布麻纤维及超临界CO2萃取黄酮后的罗布麻纤维各30.00 g，分别装入1 000 mL的三口烧瓶A1～A3中，然后加入900 mL乙醇溶液进行浸泡。70 ℃回流提取 2 h，负压抽滤萃取液。重复上述提取工艺3次并合并滤液，旋转蒸发使其萃取液的体积浓缩为原来的1/3，备用。

1.3 超临界CO2萃取罗布麻黄酮工艺

称取一定量的罗布麻韧皮纤维，放置于超临界CO2流体萃取反应装置的反应釜(500 mL)内。冷凝的CO2经预热器升温到临界温度以上，经高压泵升压到临界压力以上，超临界CO2流体开始对罗布麻韧皮中的黄酮进行萃取。然后继续升温升压，达到工艺要求温度和压力时开始计时，萃取结束后，缓缓打开反应釜底部的阀门开始降压，当反应釜内的压力为零时，取出反应釜内的罗布麻和分离釜中的萃取液备用。在超临界CO2流体萃取罗布麻黄酮过程中，可通过背压阀调整控制系统压力。

1.4 总黄酮含量的测定

1)标准曲线的绘制：将精密称取的干燥至恒态质量的芦丁0.01 g放置于100 mL的容量瓶A1中，然后用质量分数为60%的乙醇定容，分别将1、2、3、4、5、6 mL的芦丁溶液放置于A2～A7容量瓶中，用质量分数为5%的AlCl3溶液定容至100 mL，配制成标准芦丁溶液，静置一段时间备用。用紫外-可见分光光度计，以415 nm条件下测定的芦丁的吸光度x作为横坐标，以芦丁质量浓度y(mg/mL)作为纵坐标，绘制吸光度曲线，得到回归方程：

y=40.419x-0.847 2

2)萃取液中黄酮含量的测定：将黄酮萃取液放置于25 mL的容量瓶A8中定容，将其稀释后测试吸光度值，按照标准曲线计算黄酮的质量浓度，然后代入下式计算黄酮萃取率：

式中：E为黄酮萃取率，%；V为定容时黄酮萃取液的体积，mL；m为罗布麻韧皮质量，mg。

1.5 黄酮成分的分离检测

根据高效液相色谱法(HPLC)，采用SD-C18型色谱柱, 流动相A为甲醇溶液，流动相B为质量分数0.4%的磷酸溶液，二者体积比为 50∶50，进样量为10 μL/次，在柱温为30 ℃，流速为 1.0 mL/min的条件下，以360 nm波长进行检测。此时黄酮各成分能被检测器所检测，并且理论塔板数均不低于3 000。

1.6 抗菌性测试

以葡萄球菌和大肠杆菌为测试菌种，依据 GB/T 20944—2008《纺织品抗菌性能的评价第3部分：振荡法》对罗布麻韧皮纤维抗菌性进行测试。具体步骤为：将罗布麻萃取液加入到A1～A3三口烧瓶中，A4～A6加入对照样，A7～A9不加试样作为空白对照；分别加入磷酸盐缓冲溶液和实验室保存的3～10代待测菌种，在24 ℃、150 r/min条件下，振荡18 h。然后利用分光光度计法测试活菌浓度。

抗菌性的计算公式为

(3)

式中：Y为试样的抑菌率，%；Qt和Wt分别为A1～A3和A4～A6活菌浓度平均值，CFU/mL。

2 结果与讨论

2.1 超临界CO2萃取黄酮影响因素

罗布麻韧皮纤维经多次乙醇提取，直至黄酮质量分数不再发生变化，其值为0.92%，故可认为此为该批罗布麻韧皮纤维的黄酮含量。

2.1.1助溶剂流量与罗布麻黄酮萃取的关系

在50 ℃、20 MPa、CO2流量为 30 g/min条件下，以70%乙醇水溶液为助溶剂，研究分析助溶剂流量对罗布麻黄酮萃取的影响，选择助溶剂流量分别为0.3、0.6、0.9 g/min，结果如图1所示。

图1 助溶剂流量与罗布麻黄酮萃取的关系Fig.1 Relationship between content of cosolvent and extraction of flavonoids from apocynum venetum

由图1可以看出，罗布麻黄酮萃取率随着超临界CO2流体中乙醇溶液的增加而提高。当乙醇溶液流量为0.3 g/min，120 min时黄酮萃取率为0.196%；当乙醇溶液流量增加1倍时，120 min时黄酮的萃取率提高了71.9%。这是因为CO2是非极性分子，超临界CO2的极性会随着助溶剂乙醇溶液增加而不断增强，而极性的增强又会增大黄酮在超临界流体中的溶解度，从而提高黄酮萃取率。另一个原因是，超临界的水会破坏黄酮分子和罗布麻纤维分子之间的作用力，使黄酮分子更易从罗布麻纤维分子中脱离出来，从而提高黄酮萃取率。

当乙醇溶液流量增大到0.9 g/min时，与 0.6 g/min相比，乙醇溶液的输入量增加了50%，然而萃取率却仅提高了8.9%，且在萃取过程中还出现了压力不稳的现象。这是因为助溶剂含量过大，使水分过多，就会使超临界萃取系统中出现两相结构，即超临界CO2流体和液体水。当黄酮随超临界CO2在分离釜中分离时，由于压力下降造成水在萃取管路中的堵塞，甚至结冰使萃取系统形成了断路[10]，使反应釜中的压力不断上升，影响了萃取效果，并且对设备还有一定的危害。另外超临界流体流动性要高于液体流动性2个数量级，才具有更好的传质扩散性能。基于以上原因，选择助溶剂流量为0.6 g/min进行以下实验。

2.1.2温度与罗布麻黄酮萃取的关系

在20 MPa、CO2流量为 30 g/min的条件下，分析温度与黄酮萃取的关系，选择温度为40～60 ℃，结果如图2所示。

图2 温度与罗布麻黄酮萃取的关系Fig.2 Relationship between temperature and extraction of flavonoids from apocynum venetum

从图2可以看出：在低温阶段，随温度升高黄酮萃取率呈现出明显的上升趋势；当萃取时间为 120 min时，40 ℃黄酮萃取率为0.296%，温度升高到 45 ℃，黄酮的萃取率提高了22.3%，达到了0.362%。这是因为温度对超临界黄酮萃取具有 2方面的影响：一是温度升高，CO2密度降低，萃取效果下降；二是温度升高，CO2黏度会降低，萃取效果提高。 40 ℃时超临界CO2密度为839.81 kg/m3，黏度为78.322 μPa·s，温度升高到45 ℃，其密度和黏度分别为812.69 kg/m3、73.364 μPa·s，分别下降了3.2%和6.3%。并且随着温度的升高，黄酮的蒸汽压也随之增加，这说明在此温度范围内，相比于密度对黄酮萃取的影响，黏度和蒸汽压对黄酮萃取的影响更大。在60 ℃萃取时，黄酮的萃取率下降了19.5%。这说明在高温阶段，温度升高，超临界CO2分子间距离增大对罗布麻黄酮萃取的影响要大于超临界CO2分子间的黏度降低对萃取的影响[11]，所以温度升高，黄酮萃取率反而下降。

2.1.3压力与罗布麻黄酮萃取的关系

在50 ℃、CO2流量为 30 g/min条件下，分析压力对黄酮萃取的影响，选择压力范围为10～30 MPa，结果如图3所示。

图3 压力与罗布麻黄酮提取的关系Fig.3 Relationship between pressure and extraction of flavonoids from apocynum venetum

压力从2个方面影响着罗布麻黄酮的超临界萃取率：一是随着压力的增大，超临界CO2分子之间的距离就会减小，可溶解的黄酮分子增加，有研究[12-14]显示超临界CO2密度与溶质溶解度呈对数线性关系；二是压力升高又会增大超临界CO2分子之间的相互作用，降低黄酮在超临界CO2中的传质过程，从而降低黄酮萃取率[15]。

从图3可以看出，随着压力的增大，黄酮萃取率先显著增大，然后逐渐趋于平缓。由Peng-Robinson状态方程计算可知，50 ℃时，10 MPa下CO2的密度为 384.33 kg/m3。随着压力的不断升高，超临界CO2分子之间的距离不断减小，其密度不断增加， 20 MPa时CO2密度增加到784.29 kg/m3。当萃取时间为120 min时，10 MPa压力下的罗布麻黄酮萃取率为0.148%，而 20 MPa时罗布麻黄酮萃取率为0.337%，说明压力对密度的影响极大影响着黄酮萃取率。另外压力的增大可能还会破坏罗布麻纤维分子之间的连接，从而降低黄酮在罗布麻韧皮的传质阻力。虽然压力升高会增大超临界CO2分子间的相互作用，降低黄酮在流体中的扩散，但密度效应带来的影响要大于扩散效应，因而压力增大会提高黄酮萃取率。当系统压力继续增大，超过一定值时，黄酮萃取率开始呈下降趋势，这是由于高压阶段，由于扩散效应的影响，黄酮在超临界流体及罗布麻韧皮内的流动扩散性降低了很多。当压力高于40 MPa时，萃取率可能会降低很多，但受设备限制，需在以后实验中进行验证。

2.1.4CO2流量与罗布麻黄酮萃取的关系

在50 ℃、20 MPa的萃取条件下，以质量分数为70%的乙醇溶液为助溶剂，流量为 0.6 g/min，分析CO2流量对黄酮萃取的影响，选择流量范围为 20～40 g/min，结果如图4所示。

图4 罗布麻黄酮萃取率与CO2流量的关系Fig.4 Relationship diagram of extraction rate of flavonoids from apocynum venetum and CO2 flow rate

从图4可以看出：CO2流量为20 g/min时，在 20 MPa、50 ℃的操作条件下萃取120 min，罗布麻黄酮萃取率为0.284%；随着CO2流量的增加，黄酮的萃取率逐渐增加。当CO2流量增大到30 g/min时，黄酮萃取率提高了约20%。这是因为随着CO2流量的增加，一方面加快了CO2在反应釜中的流动速度，萃取出的黄酮能够随着CO2分子很快进入分离釜，使黄酮在罗布麻韧皮和超临界CO2流体中形成较高的浓度差，有效地提高了黄酮的扩散系数，并且使更多的超临界CO2分子与黄酮分子结合，增大了超临界CO2携带黄酮分子的能力，进而增大黄酮在CO2中的溶解[16]；另一方面会减少罗布麻表面黏性底层厚度，加快超临界CO2分子在罗布麻表面的流动性，提高了黄酮萃取率。当CO2流量继续增大到 40 g/min时，萃取率仅增加了5.36%，但是流量增大意味着对设备要求的提高，并且对高压泵的损伤也会加大。所以应综合考虑设备承受能力、成本和萃取率来选择CO2流量。

2.1.5时间与罗布麻黄酮萃取的关系

超临界CO2萃取罗布麻韧皮黄酮，按照萃取速率曲线可分为3个阶段：1)初始快速萃取阶段，在这一阶段黄酮的萃取过程由黄酮在超临界流体中的溶解度所决定，萃取速度比较恒定，并且萃取速度较快。从图2看出，45 ℃黄酮的萃取速率要小于 40 ℃，这是由于45 ℃的超临界CO2密度为 812.69 kg/m3，小于40 ℃的超临界CO2密度为839.81 kg/m3，密度的大小决定了能够溶解的黄酮的多少，从而影响此阶段的萃取速率；2)萃取中间阶段，在此过程中主要是破坏罗布麻纤维分子对黄酮的连接，所以呈现出的萃取速率比较低；3)黄酮扩散缓慢萃取阶段，即脱离束缚的黄酮分子由罗布麻韧皮内部逐渐扩散到表层。由图1～4可以看出，120 min以后，黄酮的萃取率基本趋于平缓，也就是说此时黄酮的萃取速率很小，说明剩余的黄酮分子难以脱离纤维分子的束缚，扩散过程也较慢，这也就决定了这一阶段的萃取速率。

在超临界CO2萃取罗布麻黄酮的过程中，初始阶段由于罗布麻韧皮的破碎，超临界CO2很容易把罗布麻表层自由状态的黄酮以及受罗布麻纤维分子影响较小的黄酮萃取出来。随着萃取的进行，自由状态的黄酮数量不断减少，萃取率就不断下降，直至萃取的完成。

2.2 黄酮成分的分离与检测

按照1.5节方法利用高效液相色谱对萃取的黄酮进行分离检测，标准品及各萃取液的液相色谱图如图5所示。由图5(a)所示的标准品芦丁、槲皮素和山柰酚的HPLC色谱图可知，其在色谱柱中的保留时间分别为5.36、9.96、15.46 min。由图5(b)所示的罗布麻原麻的乙醇萃取液色谱图可知，与标准品色谱图比较，相同的保留时间出现的吸收峰代表了相同的物质，罗布麻原麻萃取液中有较高的芦丁和槲皮素，而山奈酚的吸收峰很小，说明山奈酚在罗布麻韧皮黄酮中的比例比较小。图5(c)所示的罗布麻原麻的超临界萃取液的色谱图与图5(b)所示的吸收峰的位置很相似，说明超临界CO2可有效地将罗布麻韧皮中的黄酮成分萃取出来。由图5(d)所示的传统化学脱胶的罗布麻纤维乙醇萃取液色谱图可知，仍然有芦丁和槲皮素的吸收峰，说明脱胶后罗布麻纤维中仍含有一定的黄酮类物质，但其含量降低了很多。其原因有以下2点：一是在脱胶过程中，黄酮随着脱胶降解产物排放到了脱胶废液中；二是在碱、酸和氧化剂的作用下，部分黄酮类化合物化学结构发生了变化。

图5 标准品及罗布麻萃取液液相色谱图Fig.5 HPLC of standard products and lobulum extract. (a) Rutin, quercetin and kaempferol；(b) Ethanol extraction of apocynum venetum bast； (c) Supercritical fluid extraction apocynum venetum bast；(d)Ethanol extraction of apocynum venetum fiber

2.3 抗菌性分析

罗布麻韧皮、罗布麻纤维以及其乙醇萃取液和超临界萃取液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抗菌性的实验结果如表1所示。可知，黄酮含量直接影响着其抗菌性能，黄酮含量高，其抗菌性就大。在黄酮含量相近的情况下，萃取液的抗菌效果要优于麻皮及其纤维的抗菌性。罗布麻韧皮和韧皮的乙醇萃取液黄酮含量较高，对金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为89.3%和88.7%，对大肠杆菌的抑菌率分别为93.6%和93.1%。而罗布麻纤维对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率仅为59.7%和62.5%。这是因为罗布麻韧皮在脱胶过程中，非纤维素成分在酸碱氧化剂的作用下不断降解，使之与此相连的黄酮也与纤维素分子脱离，并排放到脱胶废液中，从而降低了罗布麻纤维中的黄酮含量，进而影响了罗布麻纤维的抗菌性能。罗布麻韧皮超临界萃取液也具有较高的抗菌活性，可用于织物的抗菌整理。而罗布麻韧皮经超临界萃取后黄酮含量仍有0.56%，并且抗菌效果都在80%以上。由此说明黄酮类化合物是罗布麻纤维具有抗菌性能的原因之一。