青海省海晏县线叶嵩草内生细菌的生物功能鉴定及测定

魏立娟， ， *，

(1.甘肃农业大学,甘肃 兰州730070； 2.青海大学， 青海 西宁810003)

植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内并与植物建立和谐关系的一类微生物[1-2]，随着植物微生态系统研究的不断深入，内生细菌的存在和作用已得到广泛共识[3]。几乎所有的植物中都伴随植物内生细菌的存在，其长期生活于植物体内的特殊环境中[4-5]，内生细菌可利用风、土壤颗粒、水、农业器具等多种外力条件和人类、鸟、昆虫、线虫等多种媒介从根际土壤定殖在寄主植物根内部，具有溶磷、产生植物激素、固氮、合成铁载体、诱导植物产生抗性、产生抗真菌代谢产物等多种生物功能[3]。王娜等[6]将内生细菌接入棉花苗后再接种黄萎病菌，对黄萎病菌的防治效果可达79.52%～89.79%，有助于棉花病害的防治，为棉花增产提供有力帮助；杜晓宁等[7]研究表明枸杞可培养内生细菌遗传多样性丰富，对植物病原菌有较强的抑制活性；蔡学清等[8]得出内生细菌在寄主植物的定殖情况与其保鲜效果之间存在一定的正相关性，即内生定殖是其达到保鲜效应的机制之一。植物内生细菌也是重要的微生物农药来源[9]，目前在生物防治中具有很大潜力，也作为增产菌或潜在的生防载体菌而加以利用。

线叶嵩草(Kobresiacapillifolia) 是高寒草地牧区的优势牧草，不仅能适应恶劣的环境，还能为家畜提供优质的营养物质。崔月贞等[10]与高晓星等[11]对东祁连山牧草内生细菌研究表明，其具有溶磷、固氮、产吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)作用。本试验对青藏高原青海省线叶嵩草中内生细菌的特性及其抗菌活性进行研究，以期其同样具有溶磷、固氮、产IAA等能力，本研究以期明确青藏高原高寒草地线叶嵩草内生细菌的多样性和生物功能，为合理利用极端生境牧草提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试菌株 线叶嵩草采于2016年8月37°4′8″ N，100°52′42″ E的青海省海晏县青海湖乡，并对其根部进行分离得到内生细菌。

1.1.2供试指示菌 马铃薯炭疽病菌(Colletotrlchumcoccodes)，马铃薯枯萎病菌(Fusarlumavenaceum)，马铃薯坏疽病菌(Phomafoveata)和番茄早疫病菌(Alternariasolani)，由甘肃农业大学植物保护学院植物病原细菌及细菌多样性实验室提供。

1.1.3供试培养基 肉汁胨培养基(nutrient Ager，NA)用于内生细菌分离、纯化和保存等[12]；马铃薯葡萄糖培养基(potato Dextrose Agar，PDA)用于植物病原真菌的培养和对峙实验[13]；金氏(King)培养基用于产IAA的试验；Pikovaskaia培养基(pikovaskaia’s，PKO)和蒙金娜培养基(Mehknha)分别用于溶解无机磷和有机磷试验[14]，阿须贝无氮培养基(Ashby)用于筛选固氮菌[15]。

1.2 方法

1.2.1内生细菌的分离纯化 将线叶嵩草根部组织表面用清水清洗干净，晾干后称取2 g，表面消毒后置于无菌研钵中研碎，吸取植物组织研磨浸出液按10倍浓度梯度稀释后，吸取0.1 mL涂布于NA培养基上，以最后一次洗涤水为对照，28℃培养3～7 d，根据菌落形态，颜色，大小，边缘整齐度及表面形态等分类，纯化后4℃保存备用[16]。

1.2.2生物功能测定

1.2.2.1 拮抗能力测定

采用平板对峙法测定抑菌效果[17-19]，用直径5 mm的打孔器取指示菌菌块于PDA平板中央，在指示菌四周3 cm处接种供试菌，4次重复，将马铃薯坏疽病菌放于15℃培养，其余3个指示菌放于28℃培养。以不接种供试内生菌为对照，待对照满皿后测量菌落直径，计算抑菌率[20]。

1.2.2.2 固氮能力测定

将纯化得到的内生细菌接种于NA液体培养基中，置于摇床28℃、120 r·min-1震荡培养24 h，取培养所得到的菌悬液0.1 mL接种于阿须贝无氮平板和液体培养基中，以无菌水为对照，3次重复，平板置于28℃培养箱培养，液体置于120 r·min-1震荡培养，待第7天观察，平板上有菌落或液体培养基变浑浊记为“+”，否则记为“-”。

1.2.2.3 溶磷能力测定

将活化的内生细菌涂布于PKO(无机磷)和蒙金娜(有机磷)培养基上，28℃培养14天后观察解磷圈，3次重复，根据解磷圈与菌落直径比值大小确定其溶磷能力。

1.2.2.4 产IAA能力测定

采用Salkowski比色法[21]，分别在100 mg·L-1含色氨酸和不含色氨酸的金氏培养液中接种0.1 mL菌悬液[13]，加等量无菌水为对照，置于28℃，120 r·min-1恒温震荡培养12 d，取50 μL菌悬液加入等量PC比色液，室温静置15 min后，观察显色反应，3次重复，全部变红表明能产IAA，记为“+”，否则记为“-”。

1.2.3内生细菌的鉴定

1.2.3.1 培养性状观察

将内生细菌接种于NA培养基上，在28℃无光照条件下培养72 h，观察内生细菌菌落形态特征并描述和照相。

1.2.3.2 形态观察

内生细菌在NA平板上培养经18～24 h革兰氏染色和镜检，观察菌体颜色和形态，并显微拍照。

1.2.3.3 16S rDNA鉴定

以10株内生细菌DNA为模板，使用细菌16S rRNA 基因通用引物进行扩增，扩增引物1为5'-CCG GAT CCA GAG TTT GAT CAT GGC TCA GCA-3'，引物2为5'-CGG GAT CCT ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3'，扩增体系包括25 μL 2×MasterMix，模板 2 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 19 μL，总体积50 μL，PCR程序为：94℃预变性 4 min， 94℃变性30 s， 60℃退火30 s， 72℃延伸90 s，30个循环，72℃延伸10 min。获得特异片段送到武汉金开瑞生物工程有限公司测序，并将序列上传至NCBI 进行BLAST比对分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。用Maga 6.0软件构建系统发育树，确定其系统发育学地位。

2 结果与分析

2.1 内生细菌的分离纯化

根据菌落大小、颜色、形态挑取不同单菌落，纯化后从线叶嵩草根部分离出10株内生细菌，分别编号为2G1、2G2、2G3、2G4、2G5、2G6、2G7、2G8、2G9和2G10保存备用。对照没有细菌菌落长出，说明表面消毒彻底，所得细菌均为内生细菌。

2.2 生物功能测定

除2G1和2G10对4种指示菌均无拮抗作用外，其他8株内生细菌对4种指示菌均有拮抗作用，其中对马铃薯炭疽病菌的拮抗作用最强，最强菌株是2G6，抑菌率达 88.58%， 2G8抑菌率最弱，也达66.98%，都显著高于对其他菌株的抑菌率(P<0.05)。8株内生细菌对番茄早疫病菌、马铃薯枯萎病菌和马铃薯坏疽病菌抑菌率介于32.59%～63.61%之间，其中2G5对番茄早疫病菌的抑菌率也较高为63.61%，(图1，表1)。该结果表明，除2G1和2G10以外的8株内生细菌均具有抑菌能力，具有良好的生物防治应用潜力。

图1 2G9的抑菌作用Fig.1 The antagonism effect of 2G9

10株内生细菌均能固氮，但无溶磷能力，2G1和2G10分泌IAA(表1)。该结果说明线叶嵩草根部内生细菌具有功能多样性。

2.3 内生细菌的鉴定

2.3.1培养形状观察 从10株内生细菌培养性状看线叶嵩草内生细菌在形态上存在多样性(图2)。

图2 内生细菌培养性状Fig.2 Endophytic bacteria culture traits

表1 线叶嵩草内生细菌的生物功能测定Table 1 Determination of biological functions of endophyte bacterium from Kobreais capillifolia

注：“+”：有功能；“-”无功能；同一行标不同字母表示在0.05水平差异显著

Note: “+”:With biological function;“-”:Without biological function; Different lowercase letters within the same line mean significant difference among different treatments at the 0.05 level

2.3.2形态观察 10株内生细菌均为革兰氏阳性菌，且均为杆状，菌体差别明显，2G10菌体最长，达20.29 μm，2G1菌体最宽，为1.60 μm，其他菌株长和宽均介于这两者之间(图3，表2)，表现出明显的形态多样性。

图3 内生细菌的革兰氏染色Fig.3 Gram stain of endophytice bacteria from A.inebrians

表2 内生细菌形态特征Table 2 Morphological characteristics of endophytic bacteria

注：G+：革兰氏阳性

Note: G+: Gram-positive bacteria

2.3.316S rDNA鉴定 所测序列与GenBank数据库中序列比对和构建系统发育树表明，10株内生细菌都属于芽孢杆菌属，2G1和2G10分别与芽孢杆菌属的Bacillusthuringiensis(KT965084.1)、Bacillussubtilis(JX994100.1)和Bacillussimpix(KF818620.1)一致性在99%以上，并且在系统发育树上聚在一起，初步将其分别鉴定为芽孢杆菌属的Bacillusthuringiensis和Bacillussimpix，2G2和2G9分别与Bacillusmethylotrophicus(KU877329.1、KM817258.1)的一致性在99%以上，在系统发育树上聚在一起，初步鉴定为Bacillusmethylotrophicus，2G3和2G6分别与Bacillusamyloliquefaciens(KU321524.1)的一致性在99%以上，并在系统发育树上聚在一起，初步鉴定为Bacillusamyloliquefaciens，2G4和2G5分别与Bacillussiamensis(KC851838.1)的一致性达99%，并且在系统发育树上聚在一起，初步鉴定为Bacillussiamensis，2G7和2G8分别Bacillussubtilis.(KU551205.1、KU5563 29.1)一致性达99%以上，并且在系统发育树上聚在一起，初步鉴定为Bacillussubtilis(图3)。结合前文中的培养性状和形态特征测定，将10株内生细菌分属于1个属6个种，得出线叶嵩草根部内生细菌在属的种类上比较单一，但在种的水平上有很大差别。

3讨论与结论

广泛分布于青藏高原的高山草甸对密集放牧非常宽容，这些草地中的植物群落目前正在从莎草科向禾本科物种转变，因此，正在进行的植物群落禾草替代将减少青藏高原矮嵩草甸[22]，减少青藏高原菌种资源。植物内生菌的生境特殊性决定了其既有理论研究的广度和深度，又有广泛的应用潜力，是潜力巨大且尚待开发的微生物新资源[23]。Forchetti等[24]和Zhang等[25]认为具有固氮和分泌IAA能力的植物内生细菌开发为生物菌肥有优势，本试验分离得到的2G1和2G10同时具有固氮和分泌IAA的能力，能够作为生物菌肥开发。崔月贞等[10]得出高寒草地优势牧草组织内具有丰富的可分泌IAA的内生细菌,且其中分泌IAA能力较强的菌株主要分布于线叶嵩草叶部和生长期的根部，但本试验分离出的内生细菌仅有2株具分泌IAA的能力，可能与不同地区线叶嵩草内生细菌的差异有关，但具体原因仍要进一步研究。

马铃薯是我国较为重要的粮饲兼用作物，但是近年来报道的马铃薯病害日趋严重[26],本试验分离所得内生细菌除2G1和2G10以外，其余8株内生细菌对马铃薯坏疽病菌、马铃薯炭疽病菌、马铃薯枯萎病菌和番茄早疫病菌都有较好的抑制作用，其中对马铃薯炭疽病的抑制效果最强，抑菌率分别为84.88%、84.57%、83.64%、85.80%、88.58%、86.11%、66.98%和82.41%，比崔月贞等[19]报道的最强抑菌率70.25%平均高13.07%，在马铃薯病害防治中展现出了巨大开发为生物制剂的潜力，为该菌能够更好的在大田中防治马铃薯炭疽病，还需进一步研究其抑菌机制及发酵条件优化等。此外本试验还发现2G2、2G3、2G4、2G5、2G6、2G7、2G8和2G9具有固氮能力，该研究结果为开发药肥兼用的微生物产品提供了菌种资源。

利用16S rDNA序列分析方法对内生细菌进行鉴定得出，分离所得10株内生细菌均为芽孢杆菌属，与张芳芳等[27]研究所得结果芽孢杆菌属是分离频率最高的菌种相似。试验中分离菌株均为芽孢杆菌属的原因可能在于青海温度低，其它菌株可能不能越冬，而芽孢杆菌抗逆能力强。此外本试验仅利用16S rDNA序列分析方法对内生细菌进行了鉴定，还需利用生理生化试验及(G+C)%等进一步鉴定。