p16，Ki67，CK8、17在CIN及宫颈鳞癌中的临床表达及病理意义

张力忆 蒋奉希 桂定清

宫颈浸润性鳞状细胞癌一般由上皮内瘤变演变而来，潜伏期较长，是1种常见的女性恶性肿瘤。p16作为1种抑癌基因，基本在所有的宫颈癌及病变中表达，控制细胞的生长和分化，参与肿瘤的形成和发展[1-2]。Ki67抗原是1种与细胞增殖有关的核内蛋白，可用来判断细胞增殖情况。细胞角蛋白其细胞分化状态、生理和病理环境等影响着角蛋白性质的表达方式，研究其在宫颈上皮内瘤变病变中的表现形式，可以作为研究其病症原理和诊断治疗的角度[3]。本研究运用免疫组织化学技术法检测P16、Ki67、细胞角蛋白8、17在宫颈上皮内瘤变和浸润性鳞状细胞癌中的表达，探讨其临床诊断价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月至2017年1月本院宫颈活检病例250例，患者年龄26～74岁，平均年龄(46.8±3.6)岁，其中宫颈上皮内瘤变125例(1级60例，2～3级65例)、浸润性鳞状细胞癌65例、以正常宫颈组织60例作为对照。全部病例由3位经验丰富的病理医生确诊。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：宫颈细胞正常或癌变患者；患者年龄25～75岁；研究对象均知情同意。排除标准：宫颈细胞是否正常或癌变难以确认；患者年龄<25岁或>75岁。

1.3 方法

1.3.1 试剂选取 采用型鼠抗人p16，Ki67，细胞角蛋白8、17单克隆抗体和免疫组织化学技术，结合EnVion两步法[4]按照药剂使用指示进行免疫组织化学技术操作。

1.3.2 操作步骤 制作5张5 μm石蜡标本切片，一定处理后使切片紧附在载玻片上，其中4张分别进行p16、Ki67、细胞角蛋白8、17的免疫组织化学技术染色；1张HE染色，核实病理诊断[5]。再经过一定处理后，滴加一抗鼠抗人p16、Ki67、细胞角蛋白8、17单克隆抗体50 μl，特殊处理后[6]。经冲洗、复燃、脱水、透明后封片。

1.4 标准判定

1.4.1 p16阳性判定 p16以细胞核或细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性表达。p16阳性细胞数<13%为(-)；局限在鳞状上皮中下1/4层为(+)；超过鳞状上皮中下1/4层而未超过中下3/4层的阳性表达为(++)；高于鳞状上皮的3/4层表达为(+++)[7]。

1.4.2 Ki67阳性判定 Ki67以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达。Ki67阳性细胞百分率计算值是阳性细胞数与计数细胞总数的比值，若阳性细胞表达<6%为(-)，阳性细胞数6%～28%为(+)；>28%～78%为(++)；>78%为(+++)。

1.4.3 细胞角蛋白8、17阳性判定 细胞角蛋白8、17都以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性表达。等级分配按照阳性在同类细胞中所占百分比。无着色(-)；阳性细胞、<7%为(+)；>7%～57%为(++)；>57%～77%为(+++)；>77%为(++++)。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0处理数据，计数资料使用χ2检验，一致性分析采用Kappa系数检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈病变组织p16表达情况

p16分布范围和表达范围均为细胞核与细胞质，在宫颈上皮内瘤变中存在阳性分层表达现象。浸润性鳞状细胞癌变组织中，p16强阳性表达在病变部位，且随着病变等级的升高而加强。正常宫颈组的阳性表达率为0%，宫颈上皮内瘤变低级组的阳性表达为63.3%，高级组为100.0%，浸润性鳞状细胞癌中表达为100.0%。宫颈上皮内瘤高级组与浸润性鳞状细胞癌p16阳性率差异无统计学意义(χ2=7.796，P=0.005)；正常组与高级组、低级组均有统计学差异[(χ2=7.796，P=0.005)(χ2=44.110，P=0.000)]；高级组与低级组也有统计学差异(χ2=7.596，P=0.000)，正常组与鳞癌组有统计学差异(χ2=45.021，P=0.000)。见表1。

2.2 宫颈病变组织Ki67表达情况

Ki67阳性主要在细胞核上表达，其病变部位与阳性表达部位基本一致，且伴随病变级别升高而增加。高级别组与浸润性鳞状癌细胞阳性率大体一致，无明显差异(χ2=7.896，P=0.005)；正常组与高级别组、低级别组有统计学差异[(χ2=44.110，P=0.000)、(χ2=44.121，P=0.000)]；高级别组与低级别组也有差异(χ2=7.596，P=0.006)，表达情况见表1。

2.3 宫颈病变组织细胞角蛋白8表达情况

细胞角蛋白8阳性在细胞质中，为淡黄色或棕黄色颗粒，其在宫颈上皮内瘤和浸润性鳞状细胞癌中有明显差异的表达情况，但其表达强度也随病变级别升高而增加。正常组与高级别组有统计学差异(χ2=4.110，P=0.000)；低级别与浸润性鳞状细胞癌组相比也有统计学差异(χ2=7.786，P<0.005)。见表1。

2.4 宫颈病变组织细胞角蛋白17表达情况

细胞角蛋白17的阳性表达情况，以黄色颗粒分布在细胞质中。正常组与高级组别相比有统计学差异(χ2=44.110，P=0.000)，与浸润性鳞状细胞癌组也有统计学差异(χ2=45.121，P=0.000)。高级组别与低级组别也有统计学差异(χ2=7.746，P=0.006)。见表1。

表1 p16、Ki67、CK8、CK17在宫颈组织中的阳性表达(例，%)

注：与高级组、浸润组比较，低级组*为P<0.05，#为P<0.05，##为P<0.05，#*为P<0.05。

3 讨论

宫颈癌是常见的威胁女性健康的恶性肿瘤之一，有极高的发病率和死亡率，且发病年龄有年轻化趋势，已然成为危害女性健康的第二大恶性肿瘤[8]。宫颈上皮内瘤变及浸润性鳞状细胞癌是由宫颈经过不典型增生(轻→中→重)→原位癌→早期浸润癌→浸润癌的一系列变化导致的[9-10]。根据宫颈浸润性鳞状细胞病变状态与p16、Ki67、细胞角蛋白8、17的阳性表现情况，判断宫颈上皮内瘤病变情况、浸润性鳞状细胞癌增殖状态，鉴别宫颈良恶性病变，并及时进行相关治疗[11-13]。

该研究采用免疫组织化学法进行，是通过标记抗体与特异性抗原反应显色的组织化学法，主要检测细胞内多肽、蛋白质等大分子物质，特异性强、敏感度高，广泛运用于生物学和医学研究。该研究结果显示：p16、Ki67、细胞角蛋白8、17蛋白阳性表达呈正相关，且都与宫颈浸润性鳞状细胞病变直接相关。p16分布范围和表达范围均为细胞核与细胞质，在宫颈上皮内瘤变中存在阳性分层表达现象；Ki67阳性主要在细胞核上表达，其病变部位与阳性表达部位基本一致，且伴随病变级别升高而增加；细胞角蛋白8、17阳性在细胞质中，为淡黄色或棕黄色颗粒，其在宫颈上皮内瘤和浸润性鳞状细胞癌中有明显差异的表达情况，但其表达强度也随病变级别升高而增加[14-15]。有学者表明，Ki67与p16的染色强度与病毒负荷量有关，初步说明了高病毒负荷量是导致宫颈病变进度的机制，但其他病因和机制有待下一步研究发现。

综上所述，p16、Ki67、细胞角蛋白8、17的阳性表达情况直接反映了宫颈浸润性鳞状细胞病变情况，这4个指标联合可用于辅助宫颈癌及癌前病变的早期诊治。本实验研究不足之处在于操作过程较为繁琐，且4项指标的阳性表达率偏为主观，存在实验操作误差。对于宫颈癌的研究需再进一步深入，探究宫颈癌辩证分型与浸润转移的相关性，用中医辩证思维联系宫颈癌的生物学行为，提高治疗宫颈癌水平。