季铵盐包裹溴化银纳米复合物改性树脂基质的抗菌及机械性能评价

陈银燕 张瑜 柴治国 沈丽娟 邢晓东 肖玉鸿

复合树脂以其美观与功能兼优的特点而被广泛应用于口腔临床牙体缺损修复中[1]，但是，复合树脂较其它修复材料表面更易粘附细菌[2]，且继发龋发生率高，易导致修复失败[3]。因此，研发抗菌性树脂材料是减少继发龋发生、预防修复失败的重要途径[4]。大量研究报道将银纳米颗粒或季铵盐分别添加至树脂中获得抗菌性能[2,4]。单独添加银纳米颗粒与树脂基质间无化学连接，仅简单分散于树脂基质中，因此，释出速率难以控制，抗菌活性随时间而降低。同时，抗菌成分的释出将影响载体材料的机械性能，且对周围组织产生一系列副作用[5-6]。可聚合季铵盐单体可与树脂基质成分发生聚合反应，形成化学结合[7]，因此，具有不易释出及化学性能稳定的特点，适量添加至树脂中对载体材料的机械性能无显著影响[8]，但有限的添加量限制了其抗菌活性，而添加量过大会导致化学结合不稳定、影响载体材料整体性能及稳定性等一系列问题的产生[9]。因此，两类材料在抗菌时效、抗菌效率及对载体材料的影响等方面各有优缺点，如何研发兼具两者优势的复合抗菌材料逐渐成为了学者们关注的热点。本课题组前期合成了一种新型双重抗菌材料-季铵盐包裹溴化银纳米复合物(AgBr/BHPVP)，兼具季铵盐接触抗菌及银离子缓释性能。本研究旨在通过将其添加至树脂基质中，综合评价其固化后的抗菌及机械性能，优选出改性树脂基质的AgBr/BHPVP最佳添加浓度，并验证其双重抗菌优势。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂和仪器

AgBr/BHPVP(本课题组自制)；变形链球菌UA 159(第四军医大学口腔医院微生物实验室提供)；脑心浸出液肉汤(BHI，Oxoid 公司，英国)；人工唾液(第四军医大学口腔医学院药剂科提供)；活/死菌染色试剂盒(L13152，美国)；Bis-GMA、TEGDMA、樟脑醌、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)(Sigma-Aldrich，美国)；超净工作台(HF safe-1200型，上海力申科学仪器有限公司)；厌氧培养罐(8525-A 型，沈阳)；Vitek细菌比浊仪(梅里埃公司，法国)；旋涡混合器(XW-80A型，江苏海门麒麟医用仪器厂)；微量加样器(Eppendorf，德国)；24孔细胞培养板(Corning，美国)；激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)(FluoView FV1000,日本)；万能材料试验机(岛津AGS-10kNG,日本)；显微硬度计(HXD-1000TM，上海泰明光学仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 AgBr/BHPVP的合成 通过季铵化反应将溴己烷和2-溴乙基甲基丙烯酸酯接枝到聚-4乙烯吡啶 [poly(4-vinylpyridine)，PVP]侧链上，合成季铵盐甲基丙烯酸酯(quaternary ammonium methacrylates，BHPVP)。随后，向聚合物中缓慢添加对甲苯磺酸银(silver paratoluenesulfonate solution，AgPTS)，经原位沉淀方法，AgBr以化学配位键方式结合于BHPVP侧链上，被BHPVP聚合物包裹，通过空间位阻效应稳定于该聚合物中。真空干燥24 h后得到AgBr/BHPVP(图 1)。

1.2.2 实验菌株培养 复苏变形链球菌UA 159，于37 ℃厌氧培养罐(85%N2+5%CO2+10%H2)中培养24 h。挑取单菌落接种于无菌BHI琼脂平板上，培养24 h后，将菌悬液比浊至0.5 MAC，以BHI液(含0.2%蔗糖)将菌悬液稀释100倍备用。

图 1 AgBr/BHPVP结构图

1.2.3 抗菌树脂样本制备 Bis-GMA与TEGDMA 以质量比 1∶1 组成树脂基质，加入樟脑醌(引发剂)与DMAEMA(促进剂)各0.5%，磁力搅拌器混匀，避光状态下将AgBr/BHPVP按0.5%、1.0%、1.5%质量分数添加至树脂基质中作为改性组，未添加AgBr/BHPVP的树脂基质作为空白对照组，根据前期热重分析结果，同时设置3 个中间对照组：0.13%AgBr(MA)、0.87%BHPVP(MB)、0.13%AgBr+0.87%BHPVP(MA+B)组，抽真空排气泡避光保存备用。分组配制后将树脂充填于内径10 mm、高1.5 mm 的聚四氟乙烯模具中，覆盖聚乙烯薄膜，光固化。经水砂纸逐级打磨抛光后置37 ℃去离子水中浸泡24 h。老化3 个月样本浸泡于人工唾液中(含0.3 mmol/L叠氮化钠，以保证树脂试件表面不被细菌污染)老化处理3 个月，期间，37 ℃水浴，每2 d更换1 次人工唾液。每组每个时间点样本5 个，实验前以70%乙醇擦拭试件表面，无菌水冲洗，环氧乙烷消毒备用。

1.2.5 CLSM观察细菌活性 老化处理前后样本与变形链球菌菌悬液共培养24 h后终止培养，PBS缓冲液轻柔漂洗3 次，活/死菌试剂避光染色15 min，PBS再次漂洗，样本置CLSM下观察细菌活性。

1.2.6 机械性能检测

1.2.6.1 挠曲强度检测 根据ISO 4049标准，制作规格为25 mm×2 mm×2 mm的树脂试件，空白对照组、0.5%、1.0%、1.5%AgBr/BHPVP改性组每组9 个，光固化后，经600 目水砂纸打磨抛光，置37 ℃恒温水浴24 h。精确测量各试件的宽(w)和高(h)后，于万能试验机进行挠曲强度测试，测试速度1 mm/min，记录破坏载荷(F)，按照以下公式计算挠曲强度(flexural strength, FS)：FS=3FL/2wh2，其中L=20 mm, 为下加荷台支点间距离。

1.2.6.2 维氏显微硬度检测 制备直径 6 mm、高3 mm的圆柱形树脂试件，空白对照组、0.5%、1.0%、1.5%AgBr/BHPVP改性组每组9 个，光固化后，水砂纸逐级打磨，表面抛光呈镜面，置37 ℃恒温水浴24 h。于维氏显微硬度计上以25 g载荷对样本表面加载15 s，测试维氏显微硬度值。每个试件随机测试3 个点，计算均值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件，单因素方差分析比较不同组间总体差异，采用 LSD(方差齐) 及Dunnett’s T3(方差不齐)法进行组间两两比较。检验水准为双侧α=0.05。

2 结 果

2.1 树脂试件CFU计数

各组树脂试件表面CFU计数见图 2。老化处理前后，0.5%、1.0%、1.5%AgBr/BHPVP改性组树脂试件表面CFU均较空白对照组显著降低(P<0.05)；老化3 月1.0%、1.5%组间CFU无显著差异(P>0.05)，此外，老化处理前或处理后试件表面CFU均随AgBr/BHPVP添加量增加而减少(P<0.05)；老化处理3 月后， 0.5%、1.5%改性组CFU数量较同组别老化处理前显著增加(P<0.05)，1.0%改性组老化处理前后CFU数量间无统计学差异(P>0.05)(图 2A)。老化处理前，MA组与MB组CFU均显著高于1.0% AgBr/BHPVP组(P<0.05)，MA+B组与1.0% AgBr/BHPVP组之间CFU无显著差异(P>0.05)；老化处理后，MA、 MB、MA+B组CFU数量均显著高于1.0%AgBr/BHPVP组(P<0.05)(图 2B)。

2.2 CLSM观察

如图 3所示，其中活菌染成绿色，死菌染成红色，接近或重叠的活、死菌呈现橙或黄色。空白对照组树脂试件表面覆盖大量活细菌，呈大片绿色荧光；改性组树脂试件表面绿色荧光减少，红色荧光增多，即改性组树脂试件表面黏附的活菌量明显少于空白对照组。

2.3 机械性能的比较

各组树脂试件挠曲强度及维氏显微硬度的比较见图 4。0.5%、1.0%改性组树脂试件挠曲强度值与空白对照组比较无显著差异(P>0.05)，当AgBr/BHPVP添加量为1.5%时，挠曲强度值较空白对照组显著降低(P<0.05)。空白对照组与改性组树脂试件维氏显微硬度值均无显著性差异(P>0.05)。

图 2 各组树脂试件CFU的比较

3 讨 论

新合成的复合抗菌材料-AgBr/BHPVP引入了丙烯酸酯功能基团，在赋予其季铵盐接触抗菌及缓释银离子双重抗菌性能的同时，将其添加至树脂体系中能与树脂基质进行化学结合，发挥稳定、持续抗菌作用，适量添加对载体材料的机械性能无显著影响。

季铵盐类抗菌剂以“接触抗菌”发挥抗菌作用[10]，带正电荷的N+吸引带负电荷的细菌细胞膜，通过表面离子与疏水作用与细胞膜表面相互作用，扰乱细胞膜表面电荷分布，导致胞膜穿孔，细胞内容物泄露[11]。银离子主要通过配合供电子基团协同破坏细菌关键细胞酶及DNA的活性，使其变性，并可与细菌细胞壁肽聚糖相互作用，导致细胞结构改变，细胞壁内陷，渗透压增高，最终细胞死亡[12-14]。口腔内定植的菌种众多，其中变形链球菌是导致龋病发生的主要病原菌[15]，因此，本实验中选取该菌用以测试改性树脂基质的抗菌活性。从树脂对变形链球菌 UA 159的抗菌活性结果可以看出，老化处理前后改性组试件表面CFU均显著低于空白对照组(P<0.05)。老化3 月后，0.5%、1.5%改性组CFU数量均较同组别老化前增多(P<0.05)，而1.0%改性组老化3 月后试件表面CFU较老化处理前无显著差异(P>0.05)，从而优选出AgBr/BHPVP添加于树脂基质的适宜浓度。而后，根据前期热重分析结果，AgBr/BHPVP中AgBr质量约占13%，故设立0.13%AgBr、0.87%BHPVP、0.13%AgBr+0.87%BHPVP 3 个中间对照组，与优选出的1.0%AgBr/BHPVP组进行比较，进一步行老化前后对变形链球菌的抗菌实验。结果显示，除老化处理前0.13%AgBr+0.87%BHPVP 组与1.0%AgBr/BHPVP组CFU数量无显著差异(P>0.05)外，1.0%AgBr/BHPVP组老化处理前后CFU均显著低于各中间对照组(P<0.05)。故AgBr/BHPVP改性树脂基质表现出良好的抗菌长效性。前期实验研究已证实AgBr/BHPVP可缓慢释放银离子，单体具备抗菌长效性，结合此实验结果，可进一步说明AgBr/BHPVP添加至树脂基质中固化后，亦赋予载体材料持续、稳定、长效的抗菌性能，其抗菌性能优于单独添加AgBr或BHPVP，以及将AgBr与BHPVP同时混合添加入树脂基质中。

图 3 激光共聚焦显微镜观察各组树脂试件表面黏附的变形链球菌 (CLSM, ×40)

Fig 3 CLSM observation of S.mutans on the surface of resin specimens (CLSM, ×40)

图 4 AgBr/BHPVP改性树脂基质机械性能的比较

Fig 4 Comparison of mechanical properties of AgBr/BHPVP modified resin matrix

树脂修复材料在口内行使功能时遇到的两大挑战分别是继发龋和修复体折裂[16]。因此，除具备抗菌活性以外，材料自身刚度需达到一定程度才能保障其在口腔中良好地行使功能。挠曲强度测试相比压缩强度测试，前者对材料亚结构的轻微变化敏感性更高[17]，故本实验选用挠曲强度作为评价改性后树脂基质机械性能的指标之一。该实验中，当树脂基质中AgBr/BHPVP添加量为0.5%、1.0%时，挠曲强度与空白对照组间无显著性差异(P>0.05)，且其挠曲强度值均位于80 MPa以上，符合ISO 4049标准要求[18]。但当添加量达1.5%时，挠曲强度下降，与空白对照组比较有统计学差异(P<0.05)。其原因可能在于树脂体系中过量AgBr/BHPVP与树脂基质间无法形成化学结合，从而形成不良接触界面，孔隙增加，受力时易导致应力集中，材料整体强度降低。硬度是衡量材料软硬程度的指标，常被用以表征材料的耐磨损性能。临床上常用的Bis-GMA和TEGDMA纯树脂基质的其维氏显微硬度值介于100～200 MPa[19]，本研究中实验结果显示，利用AgBr/BHPVP对树脂基质进行改性，各组维氏显微硬度值均高于100 MPa，与空白对照组接近，其差异无统计学意义(P>0.05)。

综上所述，经适量AgBr/BHPVP改性的树脂基质在体外对变形链球菌具有持续、稳定、长效的抗菌活性，当添加量为1.0%时，老化处理前后均表现出良好的抗菌活性，对材料的挠曲强度及维氏显微硬度无不利影响，在口腔修复材料领域有良好应用前景。