MicroRNA-192、ZEB1对膀胱癌上皮-间质转化的影响

井岗山，江志强

（1.山东省肥城矿业中心医院，山东 肥城 271608；2.山东省即墨市人民医院，山东 即墨 266200）

膀胱癌作为常见的恶性肿瘤，发病率位居泌尿系统恶性肿瘤首位，具有多发、易复发等特点，且复发后肿瘤恶性程度增加，严重威胁人类健康[1]。目前，该肿瘤的发病及复发机制尚不清楚。microRNA（miRNA）作为一类高度保守的非编码短小RNA，在细胞增殖、分化、凋亡、器官发育、免疫等多种生理功能中发挥重要作用，亦参与多种恶性肿瘤发生、发展及转移过程[2]。研究表明，膀胱癌患者外周血miRNA表达谱发生异常[3]。microRNA-192（miR-192）作为miRNA重要类型，在多种恶性肿瘤组织中表达异常，参与肿瘤发生、发展过程[4]。亦有研究指出，miR-192表达失调可能在上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition, EMT）过程中发挥重要作用[5]。而EMT参与与恶性肿瘤细胞增殖、迁移及耐药过程。本研究对膀胱癌组织中miR-192、EMT相关指标进行检测，并与正常膀胱黏膜组织进行比较，探讨其在膀胱癌发生、发展中的意义，为膀胱癌机制研究提供基础资料。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2013年5月-2015年6月在山东省肥城矿业中心医院泌尿外科择期行手术治疗的膀胱癌患者96例作为膀胱癌组，均经病理学诊断证实为膀胱上皮移形细胞癌。其中，男性62例，女性34例；年龄37～74岁，平均（63.8±9.7）岁；初发肿瘤62例，复发肿瘤34例；单发肿瘤55例，多发肿瘤41例；病理学分级：高分化32例，中低分化64例；TNM分期：T0、T1期38例，T2～T4期58例。同期留取外伤性膀胱破裂患者正常膀胱黏膜组织41例作为对照组，均经病理学诊断证实为正常膀胱黏膜组织。其中，男性29例，女性12例；平均年龄（61.9±8.2）岁。两组患者性别、年龄等一般情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。将留取的膀胱癌及正常膀胱黏膜组织迅速放入液氮中，保存于-80℃冰箱以备检。本研究通过本院伦理委员会批准，所有患者知情同意。

1.2 主要试剂及设备

Trizol总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司），逆转录聚合酶链反应试剂盒购自上海拜力生物科技公司，miR-192及内参U6、锌指结构转录因子1（zinc finger transcription factor 1, ZEB1）及内参β-actin引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，兔抗人ZEB1多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），鼠抗人E钙黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗体（北京中杉公司），鼠抗人波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）仪（美国ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 采用qRT-PCR检测不同组织中miR-192和ZEB1基因的表达。取冻存组织，研磨后加入细胞裂解液，用Trizol总RNA提取试剂盒提取总RNA，紫外分光光度计检测总RNA，取A260/A280≥1.80作为合格样品。逆转录获得模板单链cDNA，以cDNA为模板进行PCR。miR-192正向引物 ：5’-CTGACCTATGAATTGACAGCC-3’，反向引物：5’-CAGTGCAGGGTCCGACCTATT-3’；U6正向引物：5’-TCAGTTTGCTGTTCTGGGTG-3’，反向引物：5’-CGGTTGGCTGGAAAGGAG-3’；ZEB1正向引物：5’-GCACAACCAAGTGCAGAAGA-3’，反向引物：5’-CATTTGCAGATTGAGGCTGA-3’；β-actin正向引物：5’-TGGCACCACACCTTCTACA-3’，反向引物：5’-AGCACAGCCTGGATAGCA-3’。PCR反应条件：94℃预变性1 min，92℃变性30 s，56℃退火30 s，74℃延伸30 s，共40个循环。每个样品设置3个平行反应复孔。采用2-△△Ct法计算组织中miR-192和ZEB1基因的相对表达量。

1.3.2 免疫组织化学法 采用免疫组织化学法检测不同组织中ZEB1、E-cadherin和Vimentin的表达。取不同组织，用4%甲醛固定后，石蜡包埋、切片，厚约5μm。经脱蜡、水化、微波抗原修复、过氧化氢孵育，滴加一抗兔抗人ZEB1、E-cadherin和Vimentin多克隆抗体（稀释比例1∶300、1∶800和1∶1 000），4℃湿盒过夜孵育，加入通用型二抗，37℃湿盒孵育30 min。二氨基联苯胺显色剂显色，苏木精复染，分化、返蓝、脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：ZEB1主要以细胞质和细胞核出现黄色或棕黄色团块状或颗粒状染色为阳性，E-cadherin和Vimentin主要以细胞膜出现黄色、棕褐色均质染色为阳性。在高倍镜下随机选取5个视野，根据着色细胞比例进行判定：＜90%为表达异常，≥90%为表达正常。

1.3.3 Western blot检测 采用Western blot检测不同组织中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表达。取组织研磨后加入细胞裂解液，对总蛋白进行提取，用BCA法对蛋白浓度进行检测。取蛋白30μg，用10% SDS-PAGE进行电泳分离，经电转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉在室温下封闭60 min，分别加入一抗兔抗人ZEB1多克隆抗体、鼠抗人E-cadherin多克隆抗体和鼠抗人Vimentin单克隆抗体（稀释比例分别为1∶500、1∶1 200和1∶2 000），过夜孵育，用TBST漂洗3次，将HRP标记的IgG二抗加入（稀释比1∶1 000），室温下孵育60 min，TBST漂洗3次，ECL化学发光显色液显色。采用Quantity One图像分析软件对获得的电泳条带进行分析，计算不同组织中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的相对表达量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验，相关性分析用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中miR-192和ZEB1基因表达水平比较

2.1.1 miR-192 膀胱癌与对照组组织中miR-192相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），膀胱癌组织中miR-192相对表达量低于对照组。见表1。

2.1.2 ZEB1 mRNA 膀胱癌与对照组组织中ZEB1 mRNA相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），膀胱癌组织中ZEB1 mRNA相对表达量高于对照组。见表1。

表1 不同组织中miR-192和ZEB1基因表达水平比较（±s）

表1 不同组织中miR-192和ZEB1基因表达水平比较（±s）

组别 miR-192 ZEB1 mRNA膀胱癌组（n =96） 0.58±0.07 0.61±0.09对照组（n =41） 0.93±0.11 0.32±0.06 t值 23.686 18.279 P值 0.000 0.000

2.2 膀胱癌组织中miR-192和ZEB1基因表达水平与临床病理特征的关系

膀胱组织中miR-192和ZEB1 mRNA表达水平与年龄、性别、发病阶段、肿瘤数量及肿瘤大小无关（P＞0.05），与病理学分级、TNM分期及是否淋巴结转移有关（P＜0.05）。见表 2。

2.3 不同组织中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表达

免疫组织化学染色结果显示，ZEB1主要表达于细胞质和细胞核，在膀胱癌组织中呈高表达；E-cadherin主要表达于细胞膜，在膀胱癌组织中呈低表达；Vimentin主要表达于细胞膜，在膀胱癌组织中呈高表达。见图1。

2.4 不同组织中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白表达水平比较

Western blot结果显示，膀胱癌和对照组组织中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），膀胱癌组织中ZEB1和Vimentin蛋白表达水平高于对照组，E-cadherin蛋白表达水平低于对照组。见表3和图2。

2.5 膀胱癌组织中miR-192与ZEB1、E-cadherin、Vimentin蛋白表达水平的相关性

Pearson相关性分析显示，膀胱癌组织中miR-192与ZEB1、Vimentin蛋白表达水平呈负相关（r=-0.279和-0.318，均P=0.000），与E-cadherin蛋白表达水平呈正相关（r=0.376，P=0.000）。

表2 不同影响因素膀胱癌组织中miR-192和ZEB1基因表达水平比较

图1 不同组织中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表达 （免疫组织化学法×20）

表3 不同组织中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白表达水平比较 （±s）

表3 不同组织中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白表达水平比较 （±s）

组别 ZEB1蛋白 E-cadherin蛋白 Vimentin蛋白膀胱癌组（n =96） 1.27±0.15 0.51±0.10 1.34±0.13对照组（n =41） 1.09±0.12 0.78±0.14 1.12±0.11 t值 6.515 11.770 7.594 P值 0.000 0.000 0.000

图2 不同组织中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表达

3 讨论

膀胱癌作为泌尿系统常见恶性肿瘤，发病率高、复发率高，且每次复发后恶性程度常增加[6]。有研究指出，miRNA参与膀胱癌的发生、发展过程，且与膀胱癌复发有关[7]。miR-192作为miRNA类型之一，参与胃癌[8]、肺癌[9]、子宫内膜癌[10]等多种恶性肿瘤发生、发展过程。亦有研究指出，miR-192过表达可抑制人膀胱癌细胞增殖，诱导凋亡[11]。本研究结果显示，膀胱癌组织中miR-192表达水平低于对照组，说明miR-192在膀胱癌组织中呈低表达，可能参与膀胱癌发生过程；膀胱组织中miR-192表达水平与病理学分级、TNM分期、是否淋巴结转移有关，病理学分级越低、TNM分期越高、发生淋巴结转移，miR-192表达水平越低，进一步说明miR-192低表达参与膀胱癌发生、发展、转移过程，可能发挥抑癌基因功能。

有研究表明，EMT在肿瘤细胞原位浸润及远处转移中发挥重要作用。EMT出现异常时，可导致细胞表型及结构发生改变，使上皮细胞极性丧失、间质特性增强，从而使细胞间黏附力减弱甚至消失，加速细胞迁移及转移[12]。ZEB1作为EMT过程中重要的转录调控因子，可通过与E盒位点结合而参与EMT过程[13]。本研究结果显示，膀胱癌组织中ZEB1 mRNA和蛋白表达水平高于对照组，说明ZEB1在膀胱癌组织中表达异常，且病理学分级越低、TNM分期越高、发生淋巴结转移，ZEB1 mRNA表达水平越高，说明ZEB1在膀胱癌组织中呈高表达，可能通过EMT过程而参与膀胱癌发生、发展及转移。E-cadherin作为介导细胞间黏附的跨膜糖蛋白，其表达降低或缺失可使细胞间黏附力降低，是EMT发生的标志[14]。Vimentin蛋白作为纤维蛋白，是EMT发生的重要标志物，其表达水平越高往往预示肿瘤恶性程度越高[15]。本研究结果显示，膀胱癌组织中Vimentin蛋白表达水平高于对照组，而E-cadherin蛋白表达水平低于对照组，进一步说明EMT可能参与膀胱癌侵袭、转移过程。Pearson相关性分析显示，膀胱癌组织中miR-192与ZEB1、Vimentin蛋白表达水平呈负相关，与E-cadherin蛋白表达水平呈正相关，说明miR-192低表达可能通过负性调控ZEB1而参与EMT过程，从而促使膀胱癌发生、发展及转移。

综上所述，miR-192在膀胱癌组织中呈低表达，而ZEB1呈高表达，miR-192可能通过负性调控ZEB1，促进EMT过程，从而加速膀胱癌的浸润和转移。