自拟黄芪葛根汤治疗实验性自身免疫性重症肌无力大鼠的免疫机制研究*

钱立锋 姚 青 王晓燕 左 瑞

1 浙江省嘉兴市中医医院 浙江 嘉兴 314001 2 陕西省西安市中医医院 陕西 西安 710021

目前，现代医学治疗重症肌无力（MG）大多只能控制症状，且疗效报道不一，该病缺乏彻底根治的疗法,病情严重时危及生命。笔者通过动物实验试从免疫学指标初步探索其内在的免疫调节机制，以期为中医药治疗MG的有效性提供客观的依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物：SPF三级8周龄Lewis大鼠50只，雌性，体重171～185g，实验动物编号：012，由西安交通大学动物实验室提供。饲养在SPF级动物实验室内喂养无菌水和标准无菌颗粒饲料，所有大鼠毛色光滑润泽，足底红润，反应敏捷。

1.2 实验试剂及药物：鼠源性AChR-α亚基97-116肽段序列，纯度：98.26%，规格：5mg/支，由武汉星皓医药公司提供；完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、磷酸缓冲液（PBS）由德国SIGMA公司提供；阿托品注射液（东北制药集团）；新斯的明注射液（上海信谊药厂）；强的松片（浙江仙琚制药有限公司）；Rat AChR-Ab、IL-6 ELISA 试剂盒（上海UNIV-Bio科技公司）；自拟黄芪葛根汤(生黄芪、葛根、桂枝、赤芍、炒白术、茯苓、山萸肉、红参、补骨脂、生姜、大枣、生甘草)浓缩液（西安市中医医院提供）。

1.3 实验方法：分述如下。

1.3.1 实验造模：采用目前国内外常用的主动免疫造模法，参考许文华等[1]的R97-116复制 EAMG实验动物模型的方法，第一次免疫：取R97116、CFA、PBS三者充分混匀配制的免疫乳剂200μl（含R97-116：100μg）于大鼠足垫、腹部、背部进行皮下注射，取等量PBS液对正常组进行相同处理；第30天及第45天进行强化接种免疫，取提前配制的加强免疫乳剂200μl（含R97-116：50μg）进行强化免疫，正常组皮下注射等量PBS。

1.3.2 EAMG模型评估及纳入标准：通过测量肌力和新斯的明试验来观察造模后情况。①测量肌力（即让大鼠反复抓握笼顶30s后再测量）：采用Lennon评分标准予以肌无力症状评分。具体评分标准：0分：正常肌力，无异常；1分：出现轻度的活动减少，大鼠撕咬抓取力量减弱，极易疲劳；2分：大鼠的活动较前明显减少，体重逐渐减轻，身体成拱起的姿势，头和尾出现下垂，双前肢弯曲，行走不平稳伴震颤；3分：大鼠出现严重的全身无力，抓取、撕咬动作消失，身体震颤，临死表现；4分：大鼠死亡。症状介于2个级别之间者，可以计为0.5、1.5、2.5和3.5分。②新斯的明实验：造模后的大鼠经腹腔注射新斯的明（37.5μg/kg）和硫酸阿托品（15μg/kg），观察12min后大鼠肌无力症状若能缓解并且持续2～12h，可以判定为新斯的明试验结果为阳性。纳入标准：满足Lennon评分≥1分为肌无力阳性，同时经新斯的明试验结果为阳性者纳入。

1.3.3 实验分组与给药：选取50只健康SPF级8周龄的雌性Lewis大鼠，随机选取8只设为正常组，剩下的进行EAMG造模，将成模的32只EAMG大鼠随机分为模型组，阳性药物组，自拟黄芪葛根汤组。根据动物与人药物剂量的换算公式，按王晓燕教授临床治疗中黄芪常用日剂量180g换算，自拟黄芪葛根汤组给予含黄芪量为16.2mg·kg-1·d-1的自拟黄芪葛根汤灌胃，阳性药物组给予强的松5.4mg·kg-1·d-1灌胃，正常组同模型组给予等量的生理盐水灌胃。

1.3.4 检测指标：治疗4周后，①采用Lennon评分标准评估各组大鼠肌无力症状；②禁食12h后采用腹主动脉取血法抽取标本2ml，于常温下静置30min后，以3000转/分的转速离心10min后仔细提取上部透亮清液，采用ELISA法测定各组大鼠血清中的AChRab、IL-6的含量。

1.4 统计学方法：采用SPSS20.0统计软件进行数据分析。实验数据用 来表示。符合正态分布且方差齐性的条件下采用单因素方差分析，否则采用近似稳健的方差分析或Kruskal-Wallis检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠Lennon评分比较：见表1。

表1 各组大鼠Lennon评分比较（±s，分）

表1 各组大鼠Lennon评分比较（±s，分）

注：与正常组比较，△P＜0.05；与模型组比较，★P＜0.05。

治疗4周后组别 例数 造模后0.00±0.00 1.87±0.35 0.94±0.32★0.44±0.18★正常组模型组阳性药物组自拟黄芪葛根汤组8 8 8 8 0.00±0.00 1.81±0.46△1.75±0.38△1.81±0.37△

2.2 治疗后各组大鼠血清AChRab含量的比较：表2。

表2 治疗后各组血清AChRab含量比较（±s）

表2 治疗后各组血清AChRab含量比较（±s）

注：与正常组比较，△P＜0.05；与模型组比较，★P＜0.05；与自拟黄芪葛根汤组比较，●P＜0.05。

AChRab（ng/ml）组别 例数0.85±0.10 7.70±0.70△3.81±0.33★●4.69±0.50★正常组模型组阳性药物组自拟黄芪葛根汤组8 8 8 8

2.3 治疗后各组大鼠血清IL-6含量比较：见表3。

表3 治疗后各组血清中IL-6含量比较（±s）

表3 治疗后各组血清中IL-6含量比较（±s）

注：与正常组比较，△P＜0.05；与模型组比较，★P＜0.05；与正常组比较，*P＜0.05。

IL-6（pg/ml）42.40±6.82 77.88±7.41△29.74±3.54★*45.21±6.63★●组别正常组模型组阳性药物组自拟黄芪葛根汤组例数8 8 8 8

3 讨论

重症肌无力可归属于中医学中“痿证”范畴，由内伤、外感及多种因素引起。课题组王晓燕教授通过对MG患者的长期观察，从气的生理功能进行分析认为，先天禀赋不足或病后失调损伤正气、劳逸过度、长期熬夜等因素均可导致肾阳不足、元气亏虚。提出了以“益气升提，培元固本”的治疗原则，选用自拟黄芪葛根汤临证加减。方中黄芪为君药，尤擅长于益脾气；本方中黄芪重剂使用，文献研究[2]发现黄芪一直有大量使用的情况，既补气又能升气，从而达到升阳举陷的效果。现代药理实验[3-4]证实黄芪能够双向调节紊乱的人体免疫系统；对干扰素系统有促进作用；加速B细胞成熟和浆细胞抗体合成，对T细胞和B淋巴细胞具有明显的免疫增强作用，提高细胞和体液免疫能力；其所含的多糖类物质能够平衡淋巴细胞各个亚群的比例和正常抗体的生成，从而增强其免疫平衡作用。葛根，能够升阳发表、鼓舞脾胃之气而达到生津液、起阴气、载药上行的目的，同时还能够制约大剂量黄芪的温燥之性。桂枝、赤芍、茯苓、炒白术起益气健脾、调和脾胃之效；山萸肉味酸性涩，入足厥阴肝经，使补中有固；再加之红参、补骨脂能益气固肾，肾气足而阳气旺，肾坚固而气不散。生姜、大枣固护脾胃、益气生津；甘草调和药性。诸药合用，能使中焦健运而运化无穷，气机升降有序而气血和畅，共奏健脾补中、益气升提，温肾中之寒水、荣机体之四末的功效。