建昌黑山羊类固醇21-羟化酶基因部分序列的多态性研究

王慧宇，赵龙，范中涛，吕珽

（西昌学院，四川 西昌 615013）

建昌黑山羊广泛分布于凉山彝族自治州，该品种山羊耐粗饲、易管理、抗病力强、生产性能较高，在当地地方经济发展中占有很重要的地位[1]。DNA分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传变异的直接反映。在分子遗传标记中，单链构象多态性（SSCP）技术是最常用的方法之一，主要用于检测碱基突变[2]。类固醇21-羟化酶，是肾上腺类固醇激素合成调控的关键酶之一，由CYP21基因编码，包含10个外显子和9个内含子。17-羟孕酮及孕酮在21-羟化酶的作用下，分别转化成脱氧皮质醇和脱氧皮质酮，最终产物分别是去氧皮质醇和去氧皮质酮[3]。而17-羟孕酮、孕酮、皮质醇等类固醇激素在调节动物的繁殖、生长及生命活动中具有重要作用。

1 材料与方法

1.1 羊群来源及样本采集 检测羊群来自四川省会理县建昌黑山羊种羊场，采集具有不同产羔数的母羊的血液样本62份，记录其生产数据。每只羊都从颈部静脉采血5mL到真空采血管中，于实验室-20℃冰柜中保存备用。

1.2 主要试剂 血液基因DNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix（含染料）、Marker D2000、6×DNA Loading Buffer等生物制剂均购买自天根生化科技有限公司，30%Acr-Bis（29∶1）购买自 Biosharp 公司，其余是一些实验室常规药品。

1.3 DNA提取 血液样品室温下解冻，使用血液基因DNA提取试剂盒提取DNA。

1.4 引物设计与PCR扩增 根据CYP21基因DNA序列（GenBank登录号：NC_007324），对 CYP21基因第八外显子设计1对引物，目的片段大小为184bp，由杰李生物公司负责合成。

引物 1：CAGATTCAGCGCCGCCTTC；引物 2：ACT GCTAGGCCGCGTGGT。

PCR反应体系：DNA模版3.0μL，引物1、引物2（10μM）各 1μL，2×预混液 13μL，双蒸水补至 25μL，按照反应体系加入反应物混匀，按照PCR反应循环进行PCR扩增。

PCR反应循环设置：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸15s，共35个循环；然后72℃延伸7min，4℃保存。

1.5 SSCP分析 取4μL PCR 产物和6μL 6×DNA Loading Buffer试剂混匀，98℃变性10min，然后冰浴5min。变性后的PCR产物在12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中常温电泳12h，电泳结束后，银染显带，用凝胶成像仪分析。

12%非变性聚丙烯酰胺配方：30%非变性聚丙烯酰胺 12 mL，5×TBE 6 mL，10%过硫酸铵 200 μL，TEMD 15μL，加 ddH2O 12mL。

1.6 多态性分析 根据电泳结果进行基因多态性分析。

2 结果

2.1 PCR扩增 使用1%浓度的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，结果显示PCR产物特异性好，且符合目的条带大小（186bp），条带单一、明亮（见图 1）。2.2 SSCP分析 对PCR产物进行12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，所有样品的电泳图像均显示为三根条带，无变化，不存在多态性样本（如图2所示）。

图1 PCR扩增产物图

图2 PCR产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图

3 讨论

本次试验结果表明，建昌黑山羊CYP21基因的第八外显子基因序列不存在多态性，与其产羔数并无关联。闫艳[4]研究表明：辽宁绒山羊、波尔山羊、内蒙古绒山羊、济宁青山羊、安哥拉山羊5个山羊品种的CYP21基因第八外显子均没有多态性，与本试验结果一致，说明这段基因序列在各个山羊品种中的保守性高。杨志敏等[5]的研究结果表明：小尾寒羊、特克塞尔羊、多赛特羊、湖羊4个绵羊品种的CYP21基因第八外显子具有多态性。其原因可能是绵羊与山羊的CYP21基因本身就存在差别，绵羊CYP21基因第八外显子的保守性低，易突变，而建昌黑山羊的CYP21基因第八外显子具有高度保守性，出现基因突变的概率比较低所致；还可能是由于本次试验样本数量少，品种单一，未做不同品种间的比较所致。本试验初步得出建昌黑山羊的CYP21基因第八外显子不存在多态性，为以后建昌黑山羊的育种工作提供了借鉴。但建昌黑山羊CYP21基因的其余外显子是否存在多态性以及多态性是否与产羔数相关，还需进一步研究。