兔非人工通气主动脉瓣上缩窄-松解模型的建立及评价

赵 哲，陈 林，帅维正

左心室肥大是心脏对高血压、瓣膜狭窄以及主动脉缩窄等长期压力超负荷状况的适应性反应[1]。然而，长期严重的压力超负荷，会使生理性心肌肥厚发展成病理性改变[2]。主动脉瓣狭窄的患者在主动脉瓣置换术后，左心室肥大会出现逆转，但是Heinzel等[3]发现，该逆转是不完全的，表现在心肌纤维化，左室重构和功能障碍。目前，左室肥厚逆转的分子机制尚不清楚。为更好地研究左心室肥大的疾病机制及治疗方法，有必要建立一个理想的动物模型。在大多数关于左心室肥大的研究中，实验动物需行开胸手术，手术时，气管插管和机械通气往往是必需的。然而，有研究指出，气管插管可能会使实验动物出现严重的气管损伤及严重的后遗症[4]。本研究建立的兔模型可用于研究左心室肥大及其逆转，且不需气管插管，不使用机械通气。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组 健康新西兰大白兔43只，雌雄不拘，3～4月龄，体重(1.93±0.11)kg，由第三军医大学附属新桥医院实验动物中心提供，实验动物合格证书编号(渝)20017-0010。经过一段适应期后，实验动物被随机分组，37只开胸行升主动脉缩窄术(aortic banding，AB)作为模型组，6只作为假手术组(sham)。模型组中，有2只实验兔在行主动脉缩窄手术时死于气胸。其余完成手术的实验兔随机分为：升主动脉缩窄8周组(AB8w，n=6)，升主动脉缩窄16周组(AB16w，n=6)，升主动脉缩窄24周组(AB24w，n=5)，早期去缩窄(debanding，DB)组(AB8w+DB8w，n=8)，晚期去缩窄组(AB16w+DB8w，n=8)。AB8w组、AB16w组及AB24w组在相应时间点行血流动力学检查，检查结束后处死取心脏标本，行组织学检查。动物饲养与实验均遵照《第三军医大学实验动物饲养与使用规定》。

1.1.2 主要试剂、仪器及材料 戊巴比妥钠(西南药业有限公司)，硫化钠(重庆化学试剂厂)，青霉素G钠注射粉针(华北制药股份有限公司)，电子天平(德国Sartorius公司BS124S型及BS4202S型)，多功能生理记录仪(澳大利亚Powerlab公司ML870型)，超声诊断仪(挪威GE威曼超声Vivid7型，探头频率8MHz)，显微图像采集系统(德国Leica DMIRB荧光倒置显微镜)，透射电子显微镜(芬兰飞利浦TECNAI10型)。

1.2 实验方法

1.2.1 麻醉方法 将实验兔经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，不需气管插管和呼吸机，保持兔自然呼吸状态，仰卧位固定，无需给氧。手术过程中，每5 min检查1次足蹬反射。

1.2.2 手术方法 参照Zhao等[5]的方法完成兔升主动脉缩窄手术。随机分配到去缩窄组的实验兔在升主动脉缩窄术后8周及16周分别行升主动脉缩窄解除术。麻醉及术前准备同前。沿胸部原切口切皮，逐层切开皮肤，皮下筋膜，可见缝合胸部肌肉的陈旧性缝线。切开胸部肌肉至胸骨。游离胸骨下端，为预防气胸的发生，严格沿原胸骨切口剪开，直至完全分开。用儿童开胸器小心撑开胸骨，分离胸腺及粘连组织。显露升主动脉根部，找到原先结扎的Prolene线。小心分离结扎线，显露线结根部。拎着线头，用剪刀剪断线结的一侧，然后缓慢拉出完整的结扎线。胸腔内喷洒青霉素溶液400 000 U后，逐层关胸。术后正常饮食，连续3 d给予青霉素预防感染(200 000 U，肌肉注射，2/d)。

在整个实验过程中，实验兔均单笼饲养，可自由进食饮水。动物饲养室可以控制温度、湿度，并采用12 h光照、12 h黑暗的光线控制。

1.2.3 超声心动图检查 分别于术前和升主动脉缩窄术后2、4、8、10、12、16、18、20、24周，以及升主动脉缩窄解除术后2、4、8周行超声心动图检查。按照美国超声心动图协会建议的方案[6]，通过M型超声测量以下参数：心率，左室舒张末内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)，左室收缩末内径(left ventricular end-systolic diameter,LVESd)，舒张期室间隔(end-diastolic intraventricular septal thickness,IVS)及左室后壁(left ventricular wall thickness at diastole,LVPW)的厚度，左室短轴缩短率(fractional shortening,FS)。并计算左室舒张末外径(external left ventricular diastolic diameter,ExLVDd)=左室舒张末内径+舒张期左室壁厚度+舒张期室间隔厚度，左室质量指数(left ventricular mass index,LVMI){即[(ExLVDd3-LVEDd3)×1.055]/体重}，h/r(舒张期室壁厚度/左室腔的半径)比率[7]。通过多普勒超声评估升主动脉的缩窄程度及缩窄处的压力阶差。

1.2.4 血流动力学检查 实验兔麻醉后，仰卧位固定于检查台，手术分离出右颈总动脉。将与压力换能器连接并充满肝素盐水的医用导管插入颈动脉，压力换能器通过载波放大器与多导生理记录仪相连，所记录的压力代表循环血压。松开血管夹，将导管逐渐向心脏插入，一边插入一边观察电脑显示屏上的压力波形。进入左心室后，开始记录波形，缓慢后撤导管，导管接近颈动脉切口时，停止记录。利用生理记录仪自带软件Chart 5.2.1中文版，计算以下指标：左室收缩压(left ventricular systolic pressure,LVSP)，左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)，等容收缩期左心室压力上升的最大速率(+dp/dt max)，等容舒张期左心室压力下降的最大速率(-dp/dt max)，心率(heart rate,HR)。

1.2.5 组织学检查 将兔麻醉后，用电子天平(德国Sartorius公司BS4202S型)称量兔子的体重。经耳缘静脉注射肝素300 U，在胸骨左侧1 cm处开胸，完整取出心脏后用4 ℃磷酸盐缓冲液(pH=7.40)冲洗干净，滤纸吸干。去除右室、右房及左房，将左室置于电子天平(德国Sartorius公司BS124S型)上称重[8]。然后将左室置于10%甲醛溶液中固定48 h，平行房室沟将心室肌切成2 mm的薄片。石蜡包埋后，切取5 μm厚的心肌切片行HE染色。

1.2.6 透射电镜检查 拟行电镜检查的兔心脏标本，从室间隔下部取1 mm×1 mm×2 mm的长条状心肌组织数块。用2.5%戊二醛及1%锇酸固定12 h，脱水后，用环氧树脂浸润、固定、聚合24 h。取1 μm的组织切片置于载玻片上，用1%的甲苯胺蓝染色。用金刚刀切取70 nm的超薄切片，并用200目的铜载网收集，用透射电子显微镜采集图像。

2 结果

2.1 一般情况 在主动脉缩窄组中，有2只实验兔在行主动脉缩窄手术时死于气胸。有2只实验兔分别于升主动脉缩窄术后21 d及90 d死于急性心力衰竭。行主动脉缩窄解除术时，AB8w+DB8w组有1只兔子死于气胸，AB16w+DB8w组有2只兔子死于气胸。为了维持实验数据的完整性，死亡动物的超声心动图检查数据不用来分析。sham组实验兔没有死亡发生。升主动脉缩窄手术的死亡率是5.4%(2/37)，升主动脉缩窄解除术的死亡率是18.8%(3/16)。该动物实验的总死亡率是16.3%(7/43)。

2.2 超声心动图指标 升主动脉缩窄组：与术前相比，LVPW在升主动脉缩窄4周内明显增厚，之后逐渐变薄。LVMI在升主动脉缩窄后8周时增加了129.2%，8～24周没有进一步增加。FS在缩窄的前2周明显增大(P<0.01)，之后则逐渐减小。LVESd在升主动脉缩窄术后的前2周，略有减小，之后则显著增大(P<0.01)。LVEDd的变化与LVESd相似。h/r在前2周明显增大，之后则逐渐减小，说明实验兔心脏发生了由向心性肥厚到离心性肥大的转变，最明显的转折点是升主动脉缩窄术后8周。

缩窄解除组：在升主动脉解除术后的8周观察期内，LVMI明显减小，LVPW明显变薄，心室内径明显变小，这些指标都逐渐接近假手术组水平。同时，FS逐渐增加，提示心功能逐渐好转。早期去缩窄组与晚期去缩窄组也有一定差异，早期去缩窄组在术后2周的变化较晚期去缩窄组明显，而且去缩窄术后8周恢复的程度也比晚期去缩窄组更明显(P<0.01)。说明在本研究中，心脏结构、功能的恢复程度与缩窄持续的时间有关。h/r中有个有趣的现象：早期去缩窄组，在去缩窄术后4周内，其明显低于主动脉缩窄术组，去缩窄术后8周时明显高于主动脉缩窄术组，接近正常水平。这种现象出现的原因在于：升主动脉缩窄解除术后，室壁厚度明显减小，而室腔大小恢复较慢，从而造成它们的比值在术后初期明显减小。这种现象说明在去缩窄术后恢复进程中，室壁厚度的恢复要早于室腔大小的恢复。

假手术组的上述超声指标在24周的观察期内比较无统计学意义(P>0.05)，各组实验兔的心率比较无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.3 血流动力学检测 3个升主动脉缩窄组与sham组相比，LVSP差异有统计学意义(P<0.01)，AB8w+DB8w组、AB16w+DB8w组与sham组相比差异无统计学意义(P>0.05)。AB8w+DB8w组与AB16w组相比、AB16w+DB8w组与AB24w组相比，LVSP差异有统计学意义(P<0.01)。+dp/dt max的变化趋势与LVSP相似，3个升主动脉缩窄组与sham组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。-dp/dt max的变化稍有不同，AB8w组与sham组相比(P>0.05)，说明舒张功能的降低仍然不是非常明显。AB16w组、AB24w组与sham组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。AB8w+DB8w组与AB16w组相比、AB16w+DB8w组与AB24w组相比，+dp/dt max和-dp/dt max差异有统计学意义(P<0.01)。说明升主动脉缩窄解除术后，心脏的收缩功能和舒张功能都有明显好转。

AB8w+DB8w组与AB16w+DB8w组比较，-dp/dt max差异有统计学意义(P<0.01)，而+dp/dt max差异无统计学意义(P>0.05)，说明缩窄时间的长短对缩窄解除术后心脏舒张功能的恢复有重要影响。见表1。

注：与sham组比较，aP<0.01；AB24w组与术前比较，bP<0.01；与AB24w组比较，cP<0.01；AB8w+DB8w组与AB16w+DB8w组在观察期结束时比较，dP<0.01■：AB24w组，●：sham组，△：AB8w+DB8w组，◇：AB16w+DB8w组图1 各组兔超声心动图检查结果

表1 各组兔血流动力学检查结果

注：与sham组比较，aP<0.01；AB8w+DB8w组与AB16w组比较，bP<0.01；AB16w+DB8w组与AB24w组比较，cP<0.01；与sham组比较，dP<0.05；AB8w+DB8w组与AB16w+DB8w组比较，eP<0.01

2.4 左心室质量与体重的比值 实验数据表明，升主动脉缩窄术后，实验兔的左心室质量(left ventricular weight,LVW)逐渐增大，体重(body weight,BW)有所减小，故3个缩窄组的LVW及LVW/BW均较sham组明显增大(P<0.01)。AB8w+DB8w组与AB16w组、AB16w+DB8w组与AB24w组相比，LVW及LVW/BW差异均有统计学意义(P<0.01)，说明升主动脉缩窄解除后，左心室质量明显减小。AB8w+DB8w组、AB16w+DB8w组与sham组相比，LVW/BW差异有统计学意义(P<0.01)，表明升主动脉缩窄解除8周，不足以使增大的LVW/BW恢复到正常水平。AB8w+DB8w组与AB16w+DB8w组相比，LVW差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

2.5 组织学检查 光学显微镜检查：假手术组心肌纤维排列正常，间质无明显增生，无血管扩张及血管壁增厚等表现。升主动脉缩窄组心肌纤维走行紊乱，心肌细胞肥大，分支增多，间质胶原纤维显著增生。升主动脉松解术后，实验兔的心肌细胞肥大明显减轻，增生的间质胶原纤维明显减少，AB8w+DB8w组的恢复程度较AB16w+DB8w组更明显。见图2。

表2 各组兔左心室质量与体重的比值(LVW/BW)

注：与sham组比较，aP<0.01；AB8w+DB8w组与AB16w组比较，bP<0.01；AB8w组、AB16w组、AB16w+DB8w组与AB24w组比较，cP<0.01；AB8w+DB8w组与AB16w+DB8w组比较，dP<0.05

图2 各组兔术后不同时间点心肌形态学观察(HE×400)

透射电镜观察，与假手术组比较，升主动脉缩窄组兔的透射电镜表现有如下特征：①肌原纤维排列紊乱，肌节结构模糊；②闰盘结构不连续、模糊；③核膜凹凸明显；④线粒体数量明显增多，部分线粒体肿胀、破裂；⑤灶性的心肌纤维的溶解；⑥肌浆网肿胀、破裂。见图3。

图3 透射电镜观察各组兔心肌形态学改变

3 讨论

心肌肥大是影响心血管疾病预后的独立危险因子[9]。心肌肥大在早期是有益的，但是持久的心肌肥大会引起心脏收缩和舒张功能障碍，最终导致心力衰竭[10]。左心室肥厚的转归情况是患者预后的重要观察指标[11]。迄今为止，主动脉瓣置换术后左心室肥厚的转归的分子机制尚不清楚[12]。

本研究成功建立了一种去压力负荷的动物模型，该模型制作方法简单、有效、重复性好。使用兔子首次在不用气管插管和机械通气的情况下，完成了压力超负荷引起左心室肥厚并继续研究左心室肥厚的转归。该模型有2个突出的优点：①引起左心室肥厚的诱因为相对单纯的升主动脉缩窄，受药物及神经体液等因素的干扰相对较少[13]；②实验动物不需要行气管插管和人工通气，从而避免了气管插管可能引起的严重的气管损伤和后遗症，以及人工通气相关的并发症[4]。

我们之所以选择兔子作为实验动物，是因为兔子的胸腔解剖较其他动物具有独特的优势，其胸腔被纵隔分为左右两部，互不相通，肺被肋胸膜和肺胸膜隔开，心脏又被心包胸膜隔开[14]。因此，开胸时，只要不弄破纵隔膜，动物不需要人工通气，从而省掉了气管插管的麻烦。而猪、狗、鼠等动物开胸后一定要作人工呼吸，才能进行手术。

结扎线的选择也是非常重要的。普通丝线在结扎时组织损伤大，可能造成动脉破裂，而且会造成比较强的组织反应，从而导致升主动脉缩窄解除手术时去除结扎线非常困难。可吸收缝线因为有可能出现缝线被吸收、缩窄自动消除的隐患，所以不在考虑范围[15]。我们选用Prolene线作为结扎线，因为它在结扎时对组织的损伤小，组织反应轻，粘连轻，利于升主动脉缩窄解除手术时去除结扎线。在本研究中，未出现主动脉破裂的现象，缩窄解除时去除结扎线也很容易。

超声心动图可以无创监测兔心脏结构和功能的变化，并可以重复估算左心室质量[16]。在本研究中，在压力超负荷的前2周，可以观察到左心室质量和室壁厚度的快速增加，而左心室内径却减小了或保持不变。所以，压力超负荷导致的左心室肥大在早期阶段是向心性肥大，室壁增厚是左心室质量增加的主要因素。在该阶段，FS仍在正常范围，表明心脏完全代偿了增加的后负荷。升主动脉缩窄后4～8周，左心室质量和室壁厚度没有进一步增加，但是左心室腔逐渐扩大，FS降低了，意味着发生了离心性心室肥大和心脏失代偿状态。h/r比率可以很好地反映左心室内径的变化。在压力超负荷的前4周，h/r比率较假手术组增加。8周后，缩窄组的h/r比率开始低于假手术组并持续下降。FS的变化曲线与h/r比率相似，表明左心室内径与心脏功能之间有相关性。总之，这些变化反映了在该模型中实验兔心脏从向心性左心室肥大向离心性左心室肥大的转变。

升主动脉缩窄解除术后，心脏的各项超声心动图指标都有所改善，具体表现在：室壁厚度减小，心室内径减小，心室质量减小，FS增加。早期去缩窄组与晚期去缩窄组的恢复程度有一定差异，早期去缩窄组在松解术后2周的变化较晚期去缩窄组明显，而且松解术后8周恢复的程度也比晚期去缩窄组更明显。说明在本研究中，心脏结构、功能的恢复程度与缩窄持续的时间有关。h/r比率中有个有趣的现象：早期去缩窄组，在去松解术后4周内，其大小明显低于升主动脉缩窄组，术后8周又明显高于升主动脉缩窄组，接近正常水平。这种现象出现的原因在于：室壁厚度在去松解术后迅速明显减小，而室腔大小恢复较慢，从而造成h/r比率在术后初期明显减小。这种现象提示在去松解术后心室结构恢复的过程中，室壁厚度的恢复要早于室腔大小的恢复。

血流动力学检查中有类似的表现。升主动脉缩窄解除术后，血流动力学检查的多数指标逐渐恢复正常。其中，早期去缩窄组与假手术组相比没有显著差异，而晚期去缩窄组与假手术组相比则有明显差异。AB8w+DB8w组与AB16w组相比、AB16w+DB8w组与AB24w相比，+dp/dt max和-dp/dt max差异有统计学意义(P<0.01)，提示升主动脉缩窄解除术后，心脏的收缩功能和舒张功能都有明显好转。AB8w+DB8w组与AB16w+DB8w组比较，-dp/dt max差异有统计学意义(P<0.01)，提示缩窄时间的长短对缩窄解除术后心脏舒张功能的恢复有重要影响，早期解除压力负荷可以更好地改善心脏的舒张功能。

在升主动脉缩窄术后8、16、24周，LVW/BW均明显增加，较sham组相比差异有统计学意义。升主动脉缩窄组的不同时间点之间相比差异无统计学意义。说明在升主动脉缩窄术后8周时，心脏重量增加即达到高峰，这与超声检查的结果是一致的。在升主动脉缩窄解除后，左心室质量明显减小。AB8w+DB8w组、AB16w+DB8w组与sham组相比，LVW/BW差异有统计学意义(P<0.01)。肥厚心肌的恢复与肥大心肌细胞的尺寸减小有关。LVW与LVWI之间有很好的相关性(r=0.894)，说明由超声估算的左心室质量指数是可信的。

我们的研究发现，常规病理检查，升主动脉缩窄组实验兔可见心肌细胞明显肥大，肌细胞排列紊乱，间质胶原纤维明显增生。升主动脉松解术后实验兔的心肌细胞肥大明显减轻，增生的间质胶原纤维明显减少，早期去缩窄组的恢复程度较晚期去缩窄组更明显。升主动脉缩窄组的透射电子显微镜检查，亦表现出明显的特征。

我们成功建立了左心室肥厚的动物模型，该模型由压力超负荷引起左心室肥厚，并在压力负荷解除后，可以观察到左心室肥厚的逆转。该方法可避免气管插管及机械通气的损伤和并发症，效果明显、重复性好、建模时间短。本研究发现，实验兔在升主动脉缩窄后，左心室肥厚的发展与收缩功能障碍是一个时间相关的过程。该模型是研究压力负荷时心肌肥大的发生，发展和转归情况的较为理想的动物模型，肥厚心肌的逆转是目前左心室肥厚临床治疗的终极目标。

本研究也有一定的局限性。众所周知，小动物与人的左心室肥厚机制多少会有一定的差异。另外，本研究的左心室超负荷是突然发生的、急性的，而高血压或主动脉瓣狭窄患者的压力超负荷是逐渐产生的，并且会持续数年。尽管兔与人之间有明显不同，但是这是一个重要的起步，在此模型的基础上，可以进一步去探寻与心脏重塑有关的基因特征及改善心血管疾病的治疗方法。