不同恒温培养设备对利普斯E50牛奶抗生素残留检测试剂检测结果的影响试验

崔晨光

(河北 省行唐县畜牧工作总站,河北 行唐 050600)

当前，随着人民生活水平的日益提高，对牛奶产品的需求量不断增加，促进了奶牛养殖业规模化的快速发展，鲜牛奶及鲜奶制品已成为人们生活必不可少的食品之一。在奶牛养殖过程中，对奶牛疾病的治疗离不开抗生素的使用，经常被用来治疗奶牛的各种感染性疾病,而抗生素在代谢过程中残留于牛奶当中,如果人们饮用含抗生素残留的牛奶及其制品,也就相当于低剂量的吸食抗生素,从而破坏人体内的正常机能,也易造成人对抗生素产生耐药性等问题，不利于人体健康和今后疾病的治疗。因此通过加强对牛奶中的抗生素进行检测，拒收抗生素奶成为当前的重中之重。行唐县作为奶牛养殖大县，基层奶站在生鲜乳抗生素残留快速检测过程中常用的为利普斯E50牛奶抗生素残留检测试剂，该试剂制造商为西班牙ZEU-INMUNOTEC,S.L.。是国内乳品企业推荐基层奶站使用的牛奶广谱检测方法，可检测到β-内酰胺类、磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、氯霉素、林可酰胺类等抗生素，其特点是快速，安全和精确，无需样品前处理，只需一步操作，稳定。原理是基于细菌生长抑制的原理，该试剂盒包括一块微孔板，每个微孔注有分布了嗜热芽孢杆菌的琼脂培养基和 pH 指示剂。当在65℃下培养微孔板时，孢子发育生长，进而降低了培养基的pH 值，在pH 指示剂的作用下，原来的蓝(紫)色将会变为绿-黄色。如果牛奶中的抗生素浓度高于的检测限，微生物的生长和酸的生产将会受到抑制，由于没有酸生成，琼脂中的颜色将不会改变。基层奶站在检测过程中，由于各个奶站配备的恒温培养设备不同，有时检测结果出现有差异，本试验就是将利普斯E50牛奶抗生素残留检测试剂运用基层配备的具有代表性的三种不同的恒温培养设备进行检测，并读取结果，以验证其在是否存在检测结果的误差，并根据结果来总结经验体会。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

(1)“Eclipse 50 plate”利普斯E50牛奶抗生素残留检测试剂，由上海千慕生物科技有限公司提供。批号：17112102-023；规格：96次/板；冷藏避光保存(4～12)℃。对于青霉素G检出限为2～4 ppb。

(2)三元纯牛奶250 mL/盒，随机抽取奶罐纯牛奶样品200 mL

1.2 试验设备

K30电热恒温孵育器1台、wp25型电热恒温培养箱1台、DK-98-11A型电热恒温水浴锅一台、20～200 μL微量移液器一把，枪头若干。

2 样品制备

阳性样品：在三元纯牛奶添加浓度为10 ppb的青霉素G抗生素。

阴性样品：三元纯牛奶。

参照样品：奶罐纯牛奶

3 试验方法

用裁纸刀或剪子沿微孔外侧划开金属薄膜。注意不要剪开剩余的微孔板上的金属薄膜，因为这会使微孔挥发导致培养基变干。从塑料框上取下已剪开的微孔条。只需简单地用指尖向上压微孔条，微孔条即可分离出来。剩余的微孔板需立即放回塑料袋中密封在4～8℃下冷藏储存。共需取出18个微孔，将要使用的微孔板安放到另一个空的白色塑料架上，分成三组，每组6个微孔，剥开微孔上的胶粘金属膜，在每个微孔中加入50 μL牛奶样品，依次为奶罐纯牛奶、阴性样品、奶罐纯牛奶、阳性样品，需做平行试验，每个样品加2个孔，防止结果出现偏差。每吸取一个奶样更换一个干净的吸头，避免交叉污染。 用胶粘纸小心地密封微孔板(条)，将其垂直放入到已经预热到65℃的恒温孵育设备中。在使用电热恒温水浴锅时，检测试剂加好样品后，封口膜将微孔密封，最好装进自封口塑料袋中封好口，放进水浴锅中，防止水淹没试剂，造成无效检测；必须确保微孔已经完全密封。如若在培养过程中有水滴落到微孔中，将会产生错误的检测结果。培养时间按出厂报告上的时间培养(一般情况为2时45分)，也可按照阴性对照样品变黄为实验终止时间，到时间后从微孔侧面观察结果。绿-黄色或者黄色表示抗生素不存在(阴性)，蓝-紫色表示抗生素存 在(阳性)，绿-蓝色表示抗生素浓度接近的检测限。此时建议重做检测。

3 检测结果

3.1 利普斯E50牛奶抗生素残留检测试剂判定检测结果对照图如下

3.2 试验检测结果情况见下图

由图中可以看出：

(1)用K30电热恒温孵育器对利普斯E50抗生素检测试剂进行恒温培养2小时45分后，奶罐纯牛奶、阴性样品、奶罐纯牛奶、阳性样品的检测结果分别为阴性、阴性、阴性、阳性。检测结果一目了然，非常容易观察分辨。

(2)wp25型电热恒温培养箱对利普斯E50抗生素检测试剂进行恒温培养2小时45分后，奶罐纯牛奶、阴性样品、奶罐纯牛奶、阳性样品的检测结果分别为疑似、疑似、疑似、阳性。阴性样品退色不是太明显，检测结果不是太容易观察分辨，如没有阴性对照，容易误判为阳性。继续培养20分钟后，阴性样品变为黄色。

(3)DK-98-11A型电热恒温水浴锅对利普斯E50抗生素检测试剂进行恒温培养2小时45分后，奶罐纯牛奶、阴性样品、奶罐纯牛奶、阳性样品的检测结果分别为阴性、阴性、阴性、阳性。检测结果一目了然，非常容易观察分辨。

4 结论

由试验结果可以看出利普斯E50牛奶抗生素残留检测试剂对牛奶抗生素进行快速检测时，不同的恒温培养设备之间的检测结果是有误差存在的，K30电热恒温孵育器和DK-98-11A型电热恒温水浴锅相对于电热恒温培养箱的检测结果更加稳定。

5 注意事项

(1)由于利普斯E50牛奶抗生素残留检测试剂对于抗菌物质极其敏感(抗生素，磺胺类药物以及其它的消毒剂、清洗剂等)，因此应在检测过程中避免与该类物质接触，在开始检测前应彻底清洗双手，在干净的台面进行检测。否则容易出现假阳性，影响检测结果。

(2)利普斯E50牛奶抗生素残留检测试剂对牛奶抗生素进行快速检测时，选用恒温培养的设备，温度必须严格控制在65℃±1℃，超过此温度条件，检测结果会受到影响，严重的就会有假阳性和假阴性结果出现。笔者推荐使用干式恒温孵育器(如：K30电热恒温孵育器)，该机器恒温相对于其他恒温设备比较稳定，升温快，温控较好，不会出现过多的温度波动。使用电热恒温水浴锅或电热恒温培养箱时，在温度恒定65℃以后，随时注意观察温度，可用温度计监控一下，看温度偏差是否在±1℃以内。应注意温度严格必须控制在65℃±1℃，在使用电热恒温水浴锅过程中，检测试剂加好样品后，封口膜将微孔密封，最好装进自封口塑料袋中封好口，放进水浴锅中，防止水淹没试剂，造成无效检测；电热恒温培养箱因为开关箱门易造成温度大幅变动，因此可适当增加培养时间，不局限于3个小时，同时随时注意观察温度是否正常，可按照阴性样品变成黄色的时间为终止试验的时间。

(3)在试验过程中一定要加阴性和阳性样品作为对照，以保证结果的准确性。