人参裂口种子超低温保存技术研究

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(1.吉林农业大学， 长春 130118； 2.中国农业科学院特产研究所， 长春 130112)

人参(PanaxginsengC. A. Mey)为五加科多年生草本植物，能补脾益肺、大补元气，为拯危救脱之要药[1]。品种选育是人参育种工作的核心，却面临着优异资源日趋枯竭、保存体系不完善、育种周期长等问题，严重阻碍着人参育种工作的开展。为此，如何将获得的优异种群后代妥善保存，在人参育种工作中显得尤为重要。

种子是人参种质资源最为常见的保存材料。传统的人参种子保存方法是将种子采收、去掉果肉并晒干后(含水量约5%)装在种质袋中吊在通风、干燥、室温的仓库中贮藏[2]。人参种子为形态和生理后熟种子，传统的保存方法不易长期保存。文献报道，按照传统的保存方法，人参种子贮藏1年和贮藏3年后，发芽率分别降至48%和0。

研究表明，经过超低温保存后的植物材料仍具有生活力，能够保持正常细胞的遗传稳定性，且在液氮中停留的时间长短不影响其存活率[3-6]。石思信等对新采收(未完成形态后熟即未裂口)的栽培人参种子进行超低温保存，结果表明，超低温保存1年的未完成形态后熟的人参种子生活力未受到明显影响[7]；随后，张志娥等对新采收的野生人参种子进行超低温保存研究，结果表明，未完成形态后熟的野生人参种子与栽培人参种子一样，能在超低温下长期保存[8]。

本试验采用裂口的栽培人参种子(已完成形态后熟和生理后熟，子叶胚已占种仁面积的80%以上)为试材，探讨种子含水量、解冻方式等对裂口人参种子超低温保存后生活力及遗传稳定性的影响，旨在建立一套完善的栽培人参裂口种子的长期保存方法。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试人参种子来自中国农业科学院特产研究所左家人参资源圃，且已完成形态后熟和生理后熟。将人参裂口种子分别经硅胶干燥0，8，24，72 h，30 d，获取含水量为50%、30%、10%、6%、4%的5份种子。

1.2 方 法

1.2.1 含水量测定

依据《国际种子检验规程》[9]测得其含水量。

1.2.2 裂口种子生活力测定

参照文献[10]的方法，用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)法测种子生活力。将超低温保存前后的种子浸泡24 h，一切为二放入试管，加入0.1%TTC溶液和pH值为7.5的磷酸缓冲液5 mL(按1∶1比例混合)，37 ℃下水浴2 h，清水冲洗2遍，观察种子着色数以及着色程度。试验设4个重复，每重复25粒种子。

表1 含水量对超低温保存后人参裂口种子发芽势、发芽率和出苗率的影响

含水量(%) 发芽势(%) 发芽率(%) 出苗率(%) 保存前保存后保存前保存后保存前保存后5071.17±4.87c0d72.14±1.62cd0c65.14±6.76b0d3059.68±2.32d0d67.23±5.94d0c62.49±6.75b0d1088.85±1.12a91.55±3.13a90.87±2.66a95.57±2.63a85.80±3.61a87.10±2.69a677.46±2.24b72.46±2.38b81.86±3.22b76.94±5.77b69.35±1.13b74.19±4.86b462.85±1.62d61.83±2.57c75.03±4.38bc74.42±6.00b63.5±4.09b65.17±2.75c

注：同列数据中字母不同表示p<0.05差异显著。

1.2.3 发芽试验

将超低温保存前后的种子浸泡24 h，均匀摆放于有湿润滤纸的培养皿中，置于10 ℃光照培养箱。5 d后调查种子发芽情况，7 d后再次调查种子发芽情况。试验设3个重复，每重复100粒种子。

1.2.4出苗试验

将超低温保存前后的种子浸泡24 h，播种。30 d后调查种子出苗情况。试验设3个重复，每重复100粒种子。150 d后测量一年生苗株高、根长等田间生长指标。

1.2.5 解冻方式筛选

将经硅胶干燥24 h的人参裂口种子装入冻存管直接投入液氮，1周后取出，分别采用慢速解冻(4 ℃冰箱60 min)、常温解冻(25 ℃室温30 min)和快速解冻(40 ℃水浴3 min)3种方式进行解冻。

1.2.6 SSR遗传稳定性分析

采用传统CATB法提取超低温保存前后人参裂口种子的DNA，用SSR分子标记技术进行遗传稳定性分析。SSR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。

2 结果与分析

2.1 含水量对超低温保存前后人参裂口种子生活力的影响

将超低温保存前后的裂口种子进行生活力检测，结果表明：4%～50%的含水量对保存前样品的生活力几乎没有影响，染色后的胚及胚乳均呈红色；不同含水量的样品在超低温保存后的生活力差别很大，含水量在30%～50%之间时，种子不着色，无生活力。当含水量从30%开始降低时，生活力逐渐升高，含水量降至10%时，种子生活力最高，达97.67%，继续降低含水量，种子生活力逐渐降低。

2.2 含水量对超低温保存前后人参裂口种子发芽势、发芽率和出苗率的影响

将不同含水量的经超低温保存后的人参裂口种子进行发芽和出苗试验，结果如表1所示，当含水量超过30%时，经超低温保存后的人参裂口种子均不能出苗和发芽，而不经超低温保存的种子仍能保持较高的发芽势、发芽率和出苗率；随着含水量降低，当降至10%时，保存前后的发芽势、发芽率和出苗率无明显差异，均达最高值，分别为91.55%、95.57%和87.10%；继续降低含水量，保存前后的种子发芽势、发芽率和出苗率均逐渐降低，两者无显著差异。

注：同系列中字母不同表示p<0.05差异显著。图1 含水量对超低温保存前后人参裂口种子生活力的影响

2.3 解冻方式对超低温保存前后人参裂口种子发芽势、发芽率和出苗率的影响

表2为采用3种解冻方式处理超低温保存后人参裂口种子发芽和出苗的试验结果，结果表明：采用慢速、快速和常温3种解冻方式解冻样品种子，其发芽势、发芽率和出苗率均无显著差异，但40 ℃水浴快速法可明显缩短试验时间。

表2 解冻方式对超低温保存后人参裂口种子发芽势、发芽率及出苗率的影响

解冻方式 发芽势(%)发芽率(%)出苗率(%)慢速解冻91.61±0.54a91.95±0.09a81.88±1.64a常温解冻88.57±3.89a93.64±4.00a82.47±2.74a快速解冻92.31±2.08a94.65±1.51a85.95±1.78a

2.4 田间生长指标调查结果

由表3可知，超低温保存前后的人参裂口种子一年生幼苗，其株高、根长、主根粗等田间指标均无显著差异，不同含水量之间的幼苗田间指标也无明显区别。

表3 超低温保存前后的人参裂口种子田间生长指标

含水量(%)处理株高(cm)根长(cm)主根粗(mm)叶面积总鲜重(g/株)4保存前7.26±1.25a1.8±0.93a3.99±0.72a5.47±0.57a0.18±0.06a保存后7.02±1.11a1.16±0.43ab3.17±0.32ab4.70±0.14a0.11±0.01a6保存前7.44±1.35a1.52±0.38ab4.04±0.27a4.63±0.83a0.18±0.01a保存后7.38±0.63a1.04±0.42b3.71±0.45ab4.80±0.26a0.16±0.04a10保存前7.82±0.76a1.36±0.38ab4.21±0.54a5.03±0.82a0.20±0.04a保存后7.76±0.25a1.7±0.22ab4.12±0.61a5.69±0.39a0.21±0.02a含水量(%)处理地上鲜重(g/株)根鲜重(g/株)总干重(g/株)地上干重(g/株)根干重(g/株)4保存前0.06±0.03a0.10 ±0.06bc0.04±0.02bc0.01±0.01a0.03±0.01bc保存后0.06±0.01a0.06±0.02c0.036±0.01c0.01±0.00a0.02±0c6保存前0.08±0.02a0.10±0.02bc0.04±0.01b0.01±0.01a0.03±0.01bc保存后0.08±0.01a0.08±0.03bc0.04±0.01b0.01±0.01a0.03±0.01bc10保存前0.08 ±0.02a0.12±0.03ab0.05±0.01ab0.02±0.01a0.04±0.01ab保存后0.06±0.03a0.15±0.03a0.06±0.01a0.02±0.01a0.05±0.01a

注：1～10为对照组，1’～10’为处理组。图2 超低温保存前后种子DNA的SSR电泳条带

2.5 SSR分子标记结果分析

参考杨成君等[11]的方法，以pg 287为引物(上游序列GTGGGACTGGTATACAATAAGA；下游序列GTGTTCTTAGTTGCCCATTTG)，对超低温保存前后的人参裂口种子遗传稳定性进行分析，结果(图2)表明：对照组与处理组相比均无差异条带，人参超低温保存材料具有较高的遗传稳定性。

3 结论与讨论

含水量是影响超低温保存后人参裂口种子活力的重要因素。试验发现，人参裂口种子适度脱水(10%含水量)后再经超低温保存，其发芽势、发芽率和出苗率均高于对照组，这一结果与Touchell D H[12]研究结果一致。解冻方式对超低温保存后人参裂口种子的活力影响不大，但40 ℃水浴快速解冻可大大节约试验时间，同时能有效避免水分重结晶。遗传稳定性是评价超低温保存是否有效的重要指标，超低温保存后的人参裂口种子，经SSR分子标记及田间植株表型观察均未发现变异。为此，通过本试验，建立起了一套简便、可行的人参裂口种子超低温保存方法，可为珍稀人参种子资源的长期保存提供可靠的方法保障。