拟南芥CAX 1基因克隆及表达载体的构建

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(1.四川理工学院生物工程学院， 四川 自贡 643000； 2.贵州省农业科学院油菜研究所， 贵阳 550008)

作为第二信使的Ca2+,其浓度在植物细胞内受到严格的控制。正常处于静息态的细胞内钙离子浓度处于极低的水平，受到逆境胁迫如盐胁迫、干旱胁迫和病菌感染时钙离子浓度开始上升，之后又恢复至低水平。钙离子通道存在于细胞的不同部位，包括细胞膜、线粒体膜、高尔基体、液泡膜、叶绿体膜和细胞核上[1]。钙离子通道很多，可能参与不止一条植物的生理途径，即使是参与同一个途径，作用与调控机制也可能不相同。研究表明，钙离子通道参与高盐、防御干旱等逆境胁迫和抗细菌感染，但对于单个钙离子的运输通道研究并不全面[2]。研究单个钙离子通道与植物抗逆的关系对了解Ca2+在不同时空上的特异性调控是非常有意义的，比如扰乱拟南芥液泡Ca2+的ATP酶诱导了SA介导的细胞程序性死亡[3]。而CAXs家族与ACAs(Ca2+-ATPase)同样能将胞质内Ca2+转运至细胞器内或细胞外，从而降低胞质内Ca2+的浓度，与ACAs家族成员相比，CAX 1对Ca2+的转运能力强但是亲和力弱[4]。转运蛋白 (Ca2+/H+Cation Exchanger 1，CAX 1)，定位于液泡膜，利用H+浓度梯度产生ATP把Ca2+泵入液泡膜内，H+泵入细胞质，从而去除细胞质中多余的Ca2+[5]。根据研究表明，CAX 1对维持细胞内Ca2+浓度平衡，控制植物正常的生长发育[6]，以及调节植物对逆境胁迫的抗逆如盐胁迫和低温胁迫至关重要[7-8]。CAX 1能调节拟南芥叶片气孔的大小而影响气体交换，改变不同离子组分的平衡[9]，通过改变原质体pH变化调节生长素的吸收。该基因包含1 428个碱基和475个氨基酸。该课题通过利用 PCR技术从拟南芥植物中的cDNA扩增出基因CAX1与pMD 18-T载体连接得到重组质粒，再连接在一种常用的植物遗传转化双元质粒pBI 121质粒的 CaMV 35 S启动子和 NOS终止子之间[10],并进行菌落PCR验证和酶切鉴定，以期为研究转运蛋白CAX 1构建过量表达株系是否影响植物抗病提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物材料

拟南芥哥伦比亚野生型Col-0幼嫩叶片。

1.1.2 菌种和质粒

受体菌大肠杆菌DH 5 α，pBI 121质粒和pMD 18-T载体由四川理工学院实验室提供。

1.1.3 实验试剂和试剂盒

PCR相关试剂，限制性内切酶,DNA分子量标准(DL 2000)和cDNA第一链合成试剂盒购于大连宝生物Takara公司；快速质粒小提取试剂盒和RNA提取试剂Trizon购于康为世纪生物技术有限公司；低熔点琼脂糖和抗生素卡那购自sigma公司；其他常规试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 拟南芥RNA提取和cDNA的合成

于液氮中收取4周左右的拟南芥嫩叶50 mg，并在液氮中迅速充分研磨成粉末，加入1 mL Trizon提取液，反复吹打混匀；室温放置5 min，加入0.2 mL氯仿,剧烈震荡后放置3 min，低温离心15 min,将上清取至一新的RNase-Free EP管中，加入等体积异丙醇，混匀,放置10 min,离心弃上清，再用1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，离心去上清，室温晾干,加入40μL无RNase的水溶解RNA。并且电泳检测RNA质量。然后取1μg RNA按照Takara公司试剂盒说明书以Oligo(dT)为引物，反转录成cDNA第一条链。

反转录反应体系(20 μL)：

混合体系的成分反应体积5×RT-Buffer4μLdNTP Mixture(每10mM)2μLSuper-RI0.5μLRT-Enhancer0.5μLOligo (dT) primer(0.5μg/μL)1μLReverstranscriptase1μLRNA2μLRNase Free dH2O9μL

反转录反应程序： 42 ℃，40 min，99 ℃，5 min，保存在4 ℃。

1.2.2 引物和扩增CAX 1基因

CAX1基因序列号为AT 2 G 38170，开放阅读框序列在TAIR(http://www.arabidopsis.org/)上查得CDS序列，并根据其序列设计引物:F 1:5’ATGGCGGGAATCGTGACA 3’；R 1:5’ACCCGTTTTAACTTTATTTGATG 3’；以合成的第一链cDNA为模板，配制20μL PCR扩增体系后进行电泳检测。再参照T载体的酶切位点，设计出在基因两端增添酶切位点的长引物：TM:59.8，F 2:5’TGCT↓CTAGAATGGCGGGAATCGTGACA 3’含XbaI酶切位点；R 2:5’CG↓AGCTCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAACCCGTTTTAACTTTATTTGATG 3’含SacI酶切位点，PCR扩增体系电泳检测后得到正确片段后进行胶回收。

反应体系(20 μL)：

反应体系反应体积模版cDNA2μLR21μLF21μLddH2O12.3μL10×buffer(Mg2+)2μLdNTP1.5μLTaq酶0.2μL

PCR程序：

95 ℃ 3 min

72 ℃ 10 min

8 ℃ 1 h

(起始密码子和终止密码子用黑体表示，1 428个碱基)图3 CAX 1基因的核苷酸序列

1.2.3 CAX 1的克隆和基因测序

配制连接体系(10μL):经过PCR扩增后并回收的CAX1片段1.5μL，pMD 18-T载体1μL，ddH2O 2.5μL，连接buffer 5μL；置于16 ℃恒温水浴锅中连接反应2 h，并立即转化DH 5 α，并将重组质粒送到华大基因测序中心检测验证序列是否正确。

1.2.4 表达载体的构建策略

按照康为质粒小抽质粒提取试剂盒说明书，从大肠杆菌DH 5 α中提得PBI 121质粒，电泳检测。在pBI 121的多克隆位点中，本试验选择使用XbaⅠ和SacⅠ双酶切消化pBI 121并且胶回收大片段，并且消化CAX1连接在pMD 18-T载体上并测序正确的序列，用粘性末端连接策略，将CAX1连接在pBI 121的CaMV 35 S启动子和NOS终止子之间[11],从而构建CAX1的植物pBI 121表达载体，并转化受体菌大肠杆菌DH 5 α。

1.2.5 单菌落PCR检测转化结果

将转化后的大肠杆菌接种在含有卡那抗生素的LB固体培养基，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，挑取单菌落于10μL无菌水中，取混匀后的菌悬液1μL作为模版，配制20μL的PCR体系，PCR扩增后进行电泳检测结果[12]。

2 结果与分析

2.1 CAX 1开放阅读框的克隆及测序

以拟南芥cDNA为模板扩增，按照实

验方法1.2.1和1.2.2进行PCR反应扩增出的基因CAX1开放阅读框，PCR反应程序结束后用10μL PCR产物进行电泳检测，获得了一条亮较浓的1 400 bp左右的DNA片段，如图1所示，与查得的CAX1基因片段大小一致。

将此片段按照实验方法1.2.2和1.2.3继续进行PCR扩增，并且酶切进行回收，连接在pMD 18-T载体上，转化入感受态大肠杆菌，用引物F 1和R 1挑取单克隆做菌落PCR扩增后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果(图2)。图2中从左至右分别是单菌落1-3、空白、DL 2000 marker、单菌落4-6、DL 2000 marker；样5和样6两条带明显，说明质粒已经成功转化。菌落PCR得出正确条带的菌落继续扩大培养，提取质粒送出做测序，所得cDNA序列和预期序列一致(图3)。

图1 cDNA PCR扩增后CAX 1基因电泳检测结果

图2 菌落PCR验证CAX 1片段

2.2 CAX 1在表达载体上pBI 121的构建

用限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ双酶切消化测序正确的pMD 18-T载体，切下CAX1片段并且做PCR产物回收，按照实验方法1.2.4构建pBI 121的CaMV 35 S启动子和NOS终止子之间[13]。pBI 121是从结瘤农杆菌双元质粒带有GUS基因，能同时转化大肠杆菌和农杆菌，并且能通过农杆菌介导构建拟南芥稳定转化植株。本试验用SacⅠ和XbaⅠ酶切消化pBI 121，切除GUS基因，保留了CaMV 35 S启动子，然后连接CAX1 cDNA序列。

2.3 重组质粒酶切验证

将连接了CAX1 cDNA序列的重组质粒pBI 121用限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ进行双酶切验证,电泳检测结果。从左至右分别是marker、未酶切的重组质粒pBI 121和酶切的pBI 121(图4)，双酶切获得一大小在1 400 bp左右条带，验证了重组表达质粒pBI 121被成功构建。

图4 pBI 121载体重组质粒酶切后电泳检测

3 讨 论

研究表明，CAX 1对维持细胞内Ca2+浓度平衡，控制植物正常的生长发育，以及调节植物对逆境胁迫的抗逆如盐胁迫和低温胁迫至关重要[14]。因此，研究植物中CAX 1如何调控钙离子运输从而控制相关抗逆反应，影响植物乃至农作物的产量有非常重大的意义。35 S启动子是一种来自于烟草花叶病毒(TMV)强启动子且表达非常稳定，常用来驱动外源基因表达[15]。

本实验成功的构建了pBI 121以35 S启动子驱动的CAX1基因的稳定表达载体，接着将会导入到拟南芥cax1的突变体中构建互补系，与突变体cax1进行比较，是否影响植物抗病。