吊兰体细胞有丝分裂的制片研究

王昕桐，董宏鑫，刘丽萍

（黑龙江大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150080）

植物根尖染色体制片技术，是观察植物体细胞染色体最常用的方法，也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体变换的基础。绝大多数高等植物是二倍体（diploid），染色体数目恒定，其根尖细胞会进行有丝分裂，且每天都有分裂高峰定点时间段，植物根尖是观察染色体最常用的材料。在分裂高峰期取样并固定根尖，经过染色和压片，在普通光学显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体[1]。

植物细胞有丝分裂有明显的分裂周期，但其长短不同，通常在十到几十小时之间。通过预处理可以降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，阻止纺锤体的形成，让更多的细胞处于分裂中期。细胞分裂中期是染色体形态观察和计数的最佳时期，因此预处理是决定实验是否成功的关键步骤[2]。预处理可用的试剂有很多，例如秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉等。解离的目的是分解破坏分生细胞间的果胶质，细胞壁软化或分解，使细胞和染色体容易分散；利用压片技术将染色体处理在一个平面，便于形态、数量观察。解离的方法有酸解法和酶解法：酸解法是用盐酸水解根尖，步骤简便容易掌握，广泛应用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察。根尖分生组织经过酸解法和压片后，都呈现单细胞；酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色体交换等研究。本实验使用的是酸解法制片，效果良好。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本课题采用吊兰根尖为实验材料，水培吊兰根尖具有生长快、分生区明显、取材方便、二倍体植株，染色体数量适中等特点，是很好的有丝分裂制片实验材料。吊兰（Chlorophytum comosum;bracketplant），百合科多年生常绿草本植物。取水培吊兰1～3毫米具有分生区的根尖为实验材料。

1.2 实验器具和药品

1.2.1 用具六孔凹面皿，载玻片，盖玻片，温度计，试剂瓶，滴瓶，镊子，刀片，解剖针，吸水纸。

1.2.2 药品无水乙醇，70%乙醇，冰乙酸，盐酸，8-羟基喹啉，碱性品红，石碳酸，甲醛，山梨醇，中性树胶，二甲苯。

1.2.3 试剂配制卡诺氏固定液配比：无水乙醇∶冰醋酸=3∶1；离液配比：无水乙醇∶38%盐酸=1∶1。染色液：配方I，石碳酸品红（Carbol．fuchsin），先配母液 A和 B。母液A：称 3克碱性品红，溶于100毫升的70%酒精中，此液可长期保存；母液B：取母液A 10毫升，加入90毫升的5%石碳酸水溶液，2周内使用。取母液B 45毫升，加入6毫升冰醋酸和6毫升37%的甲醛。此染色液含有较多的甲醛，在植物原生质体培养过程中，观察细胞核分裂比较适宜。

配方Ⅱ，改良石碳酸品红：取配方I石碳酸品红染色液2～10毫升，加入90～98毫升45%的醋酸和1．8克山梨醇（sorbitol）。放置2周后使用染色效果显著增强，在室温下不产生沉淀而且比较稳定。

1.3 实验方法

1.3.1 预处理将水培的吊兰放在25℃左右的环境中培养，待根长到3cm左右时，分别于8:00、12:00、16:00三个时间段剪下吊兰根尖，放入0．002mol/L的8-羟基喹啉溶液中，并分组在常温下分别预处理 2h、3．5h、5h。

1.3.2 材料固定将前期预处理的根尖，现用现配卡诺氏固定液，固定材料15～20min后，如果长期保存可固定24h后转移到70%乙醇中随时取用。

1.3.3 解离将固定好的材料水洗2～3次，每次5min。放入现配的解离液（38%浓盐酸:无水乙醇=1∶1）解离5min。

1.3.4 染色制片 冲洗解离后的材料用蒸馏水反复冲洗2～3次后，用镊子截取5mm根尖放在清洁的载玻片上。将样本分为两组并标记，一组用改良苯酚品红染液染色5min，另一组用番红对照染液染色10min。分别加少量染色液，直接将染液滴在载玻片解离好的样品上，盖上盖玻片进行观察。

1.3.5 镜检将玻片标本放在干冰或冰箱冻结，后用双面刀片迅速把盖玻片和载玻片分开，滴上中性树胶或透明指甲油封片，制成永久制片。利用普通光学显微镜观察，10×10倍镜找到目标细胞后，采用10×40倍镜观察染色体。找到不同细胞分裂时期，数清染色体个数，拍照保存。

2 结果与分析

2.1 不同采样时间对实验的影响

表1 不同采样时间结果比较

由表1可知，实验中因取样时间不同，观察到的结果差别较大。结果显示，对于吊兰根尖染色体的制片，应尽量选择在上午7:00～9:00取样。上午的吊兰根尖处于分裂高峰期，样本中处于分裂时期的细胞最多，且可以观察到各个分裂时期的染色体形态，相较于其他时间段更易于观察研究。

2.2 不同预处理时间对实验的影响

8-羟基喹啉预处理可以使较多的根尖染色体处于分裂中期，此时的染色体较为短小，均匀分散在细胞中，易于查清数目与观察形态。实验选取8:00时样本预处理结果记录为表2。

表2 不同预处理时间结果比较

实验表明，预处理时间不宜过长或过短：过短的预处理时间会使染色体形态较长，互相交错缠绕，不易查清染色体个数；过长的预处理时间使染色体几乎全部处于中毒状态，染色体聚集计数困难也不易观察到各个分裂周期的特点与染色体形态[4]。因此，吊兰根尖染色体的最佳预处理时间应以3．5～4h 为宜。

2.3 吊兰各个时期染色体形态

间期：制片观察时，间期细胞个数最多，核膜核仁清晰，有明显边缘，此时观察不到染色体。前期：细胞明显变大，可以看见一些染色体呈较长螺旋状的细丝，通过螺旋作用染色体渐渐缩短变粗，随之染色体形态也就更加清晰，此时，染色体由两个染色单体组成，它们在着丝点处相连接，染色体形成的同时核膜核仁消失，这标志着前期终结；中期：染色体较粗，形态数目最为清晰，观察效果最好。由于压片操作，本应排列在赤道面上的染色体分散开，便于染色体计数。这一时期细胞中出现纺锤丝，但要仔细观察才可看到；后期：排列在赤道板上的每个染色体，从着丝点处分开，数量加倍，分别移向细胞两极。当每个染色体分开独立时，每个染色单体就成为一个新染色体，即子染色体；末期：两组子染色体分别到达两极后，即末期的开始。纺锤体逐渐消失，染色体已经分开呈浓缩状态，两个新核逐渐显现，细胞拉长，有缢裂趋势。此时期观察多个细胞会发现两个新核之间会形成细胞板。胞质分裂：明显观察到核仁核膜重新出现，新细胞壁将要形成，两个细胞即将分隔开。

2.4 吊兰染色体个数

镜检分裂中期细胞，可以清晰的观察到短粗的染色体，共2n=28条。

3 结论

通过对吊兰根尖的制片研究，观察到了前期、中期、后期、末期理想的染色体制片结果，确定吊兰为二倍体草本植物，且染色体数是2n=28。7:00～9:00时为吊兰根尖分生高峰期，此时通过3．5～4h的预处理，酸解法解离，用改良石炭酸品红滴染5min并进行压片操作后，可以获得分裂期完整、分裂相清晰的细胞。

为避免细胞紧贴在一起，制片过程中压片材料要少，材料多会致使染色体没有伸展的余地，不利于计数检测。温度明显影响植物的细胞周期，在特定的温度下培养植物根尖，便于掌握其有丝分裂高峰期，得到更多的有丝分裂周期显著特点的细胞。解离后用镊子敲打盖玻片时，用力要均匀分布在盖玻片的每一处，力过大致使细胞过于分散个别染色体丢失，或盖玻片滑动使细胞卷曲而被迫放弃分裂相良好的细胞。