间充质干细胞干性维持及多向分化相关LncRNA的研究进展

罗金莲，余泽波，王 静，李 青，阙文君，胡 雪，詹廷西

(重庆医科大学附属第一医院输血科， 重庆 400016)

干细胞(stem cells)是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。自我更新是指干细胞分裂产生至少1个具有干细胞特性子细胞的过程。分化潜能是指未分化的干细胞在一定条件下可分化为各种类型的细胞。自我更新能维持干细胞具有多分化的潜能。对于组织特异性干细胞而言，自我更新是维持其终生具有分化潜能的基础[1]。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最早发现于骨髓，同时也存在于其他组织中，如脂肪组织和脐带等。MSCs增殖与分化的平衡决定其最终归宿：平衡状态下，MSCs发育成硬骨、软骨、脂肪或其他类型的细胞；失衡状态下，则可能发生骨肉瘤等骨病变。因此，明确MSCs增殖与分化的调控机制，对于骨肉瘤治疗和骨组织工程发展等都具有重要意义。

近年来，长链非编码RNA(long noncoding RNA，LncRNA)对MSCs干性维持及多向分化的调节作用受到越来越多的关注。LncRNA是一类长度大于 200个核苷酸的非编码 RNA，曾被认为是无作用的转录“噪声”。然而，随着生物信息学和测序技术进步，越来越多的证据表明，LncRNA可能在许多生理病理过程中起着重要的调控作用，如干性维持和细胞分化、细胞周期调控、基因组印记、表观遗传调控、转录和转录后调控、肿瘤增殖迁移等。本研究通过分析国内外相关文献，就LncRNA在MSCs干性维持、多向分化及成瘤中的功能及相关机制进行综述。

1 LncRNA与MSCs干性维持的关系

MSCs的干性维持包括两个方面：自我增殖能力和分化全能性或多能性，即在合适条件下，MSCs能一直传代下去，而且分化全能性保持不变。越来越多的研究发现：LncRNA是MSCs转录调控网络的重要组成部分，对维持MSCs多向分化潜能起着关键作用。Sheik 等通过对小鼠ESCs全基因组转录调控网络分析，寻找与ESCs干性维持相关的LncRNA。他们发现LncRNA AK028326是Oct4的直接靶标，在调节反馈环中共激活Oct4。LncRNA AK141205是Nanog的直接靶标，可抑制Nanog活性。通过实验进一步证明了这些LncRNA不仅是由mESC人转录因子控制，而且LncRNA本身就可以调控mESC发育状态[1]。Wang等[2]报道：linc-RoR在人类胚胎干细胞(hESCs)的分化过程中表达急剧下降，linc-RoR可能作为竞争性内源RNA (ceRNA)调控Oct4、 Sox2和 Nanog的表达。Kretz等[3]的研究表明：LncRNA DANCR (anti-differentiation ncRNA， DANCR) 在细胞分化过程中表达急剧下降。Zhu等[4]的研究表明：DANCR可通过与 enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) 相互作用，抑制Runx2表达，从而使细胞停留在未分化状态。Jia等[5]则发现：下调DANCR可能通过经典Wnt 信号通路促进牙周膜MSCs的增殖和成骨分化。这些研究均提示DANCR在维持细胞干性方面起着重要作用，并且表明多种LncRNA在细胞干性维持方面起着重要的调控作用。

2 LncRNA 与MSCs分化的关系

2.1 与MSCs成骨分化相关的LncRNA

骨形成是一个非常复杂的过程，同一祖细胞在众多因素的作用下分化成为不同类型的骨组织。目前对成骨过程中LncRNA发挥的作用所知甚少，一些研究者对其进行了积极的探索。

Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2) 蛋白在成骨细胞的分化和骨形成方面起重要的作用。Zhu和Jia[4]的研究表明：DANCR可通过与EZH2 相互作用，抑制Runx2表达，从而阻碍成骨分化；下调DANCR则可促进MSCs的增殖和成骨分化[5]。

LncRNA H19和胰岛素样生长因子2(IGF2)是连锁交互印迹的基因,二者对细胞的增殖发挥重要的调控作用。IGF2和H19的印迹控制区由差异甲基化区(differentially methylated regions，DMR)、印迹控制区(imprinting control region，ICR)和增强子共同调节[6-7]。最近已证实，H19基因外显子还编码一个微小RNA(microRNA,miRNA)分子 miR-675[8]，而H19编码的miR-675可通过TGFβ/Smad/HDAC通路促进了成骨分化[9]。另一方面，有研究表明：H19可以作为竞争性内源RNA (competing endogenous RNA,ceRNA)活化Wnt信号通路，从而促进成骨分化[10]。笔者所在课题组前期的研究成果也表明：H19是BMP9信号通路重要的调控因素，H19可以通过调节Notch信号通路相关的miRNAs而影响成骨分化[11]。let7 miR家族已被证明是骨形成的正向调节因子， H19可以作为let-7的分子海绵调节let7的表达，使let-7的靶基因HGMA2和Dicer在蛋白水平表达上调。

Berdal等确定了一种与Msx1基因相对应的LncRNA Msx1-as。Msx1基因在牙齿和颅面发育中具有重要作用。Msx1-as可以负性调控Msx1基因的转录水平，降低Msx1蛋白水平。此外，Msx1-as还可调控Msx1蛋白在细胞内的定位，抵消Msx1对Dlx5的抑制[12-13]。

Babajko等[14]发现：lncRNA-LALR1通过激活Wnt/β-catenin信号通路，加速了小鼠肝细胞增殖和细胞周期进程。激活的β-catenin可抑制HOTAIR的表达[15]。Carrion等[16]发现:敲除人主动脉瓣膜间质细胞中的HOTAIR可增加成骨相关基因如碱性磷酸酶(ALPL)和骨形态发生蛋白2(BMP2) 的表达。HOTAIR还可通过调节miR-17-5p和它的靶基因SMAD7，在调节成骨分化和增殖中扮演重要角色[17]。

Xu等[18]研究了LncRNA (hypoxia-inducible factor 1α-anti-sense 1，HIF1α-AS1)在BMSCs成骨分化中的重要作用。通过TGF-β抑制SIRT1的表达，可上调HIF1α-AS1，促进BMSCs成骨分化。炎症微环境能减弱BMSCs成骨分化的能力。Cui等[19]发现：沉默LncRNA NONHSAT009968可改善葡萄球菌A蛋白抑制的成骨分化。Li等[20]以成骨生长肽刺激鼠MSCs，证明LncRNA AK141205通过对启动子区域内H4组蛋白的乙酰化来促进CXCL13表达，从而促进MSCs成骨分化。

表1为与MSCs成骨分化相关的LncRNA。

表1 与MSCs成骨分化相关的LncRNA

2.2 与MSCs成脂分化相关的LncRNA

PPARγ是脂肪生成的重要调控因子。Xu等[21]发现：在脂肪生成过程中，类固醇受体RNA激活物(steroid receptor RNA activator,SRA)的长链非编码RNA形式(LncRNA SRA) 通过与PPARγ共激活PPARγ依赖的受体基因表达，对前脂肪细胞的分化发挥重要作用。Sun等[22]比较分析了原代棕色和白色脂肪细胞、前脂肪细胞和培养脂肪细胞的转录组，发现了175种在脂肪生成过程中受到调控的LncRNA。这些LncRNA多数通过调节脂肪生成的重要调控因子如PPARγ、CCAAT/增强子结合蛋白 α (CEBPα)等来影响脂肪细胞的分化。通过RNAi功能缺失(loss-of-function)实验,确认了其中10种 LncRNA与脂肪细胞的分化高度相关，并将其命名为lnc-RAP-1～lnc-RAP-10，其中lnc-RAP-1 通过与异构核核糖核酸蛋白U (hnRNPU)相互作用调节脂肪生成。近期研究发现:Blnc1 (brown fat LncRNA 1)通过生成Blnc1/hnRNPU/EBF2核糖核酸蛋白复合物来促进褐色和米黄色脂肪细胞的分化，增强UCP1等产热基因的表达。此外，Blnc1本身也受EBF2调控[23-24]。Wei 等[25]的研究表明:PU.1 AS LncRNA可通过与PU.1 mRNA形成顺义-反义复合物来促进脂肪生成。上述研究结果表明:LncRNA对祖细胞的分化和脂肪生成起着重要调控作用。

表2为与MSCs成脂分化相关的LncRNA。

表2 与MSCs成脂分化相关的LncRNA

3 LncRNA与骨肉瘤的关系

骨肉瘤是一种间质来源的肿瘤。目前认为骨肉瘤是一种干细胞分化受阻的疾病。在干细胞分化的过程中，骨肉瘤细胞分化阻滞阶段越早，肿瘤恶性程度就越高，增殖就越快，也更容易转移。越来越多的研究表明：LncRNA与骨肉瘤细胞的增殖、转移及耐药密切相关。一些LncRNA 如H91、HOTAIR、TUG1、DANCR、BCAR4、FGFR3-AS1、HOTTIP、HULC、MALAT-1、UCA1等在骨肉瘤中上调，被认为是癌基因; TUSC7和MEG3 则在骨肉瘤中下调，被认为是抑癌基因。此外,LINC00161、HOTTIP、ODRUL的表达与骨肉瘤耐药相关。这些 LncRNA 调节骨肉瘤细胞的增殖、转移及耐药的机制包括ceRNA、 Wnt/β-catenin pathway等[26]。

LncRNA H19不但在成骨分化中起着重要调控作用，也与骨肉瘤的发生、发展密切相关。Ulaner等[27]的研究发现：H19和IGF2印记丢失经常出现在肿瘤中。印记丢失与H19上游CTCF结合位点的差异甲基化有关。IGF2印记表达可引起CTCF结合位点去甲基化，导致H19印记丢失[28]，促进骨肉瘤形成。敲除H19的小鼠出现过度生长的表型，可能也与H19对IGF2表达的调控有关[29]。由此可见,H19可作为抑癌因子。但是，H19也可能促进骨肉瘤形成。Li 等[30]的研究发现：H19可作为 ceRNA，通过竞争性结合miR-200s来促进骨肉瘤转移。Chan等[31]在成熟的成骨细胞中研究了Hedgehog信号在骨肉瘤发展中的作用。结果表明：Hedgehog信号异常可引起Yap1和 H19过表达，从而促进骨肉瘤形成。He等[32]的研究表明：肿瘤抑制因子miR-141过表达可抑制成骨细胞增殖，在骨肉瘤中miR-141则通过下调H19或miR-675诱导细胞凋亡。由此可见，H19在骨肉瘤的不同时期发挥着不同的作用，可以作为抑癌因子，也可能促进骨肉瘤形成。

Jiang等的研究表明：LncRNA DANCR对骨肉瘤有促瘤作用，过表达的DANCR在体外可增加骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，在体内可促进异种移植瘤生长和肺转移。pull-down分析和荧光素酶报告基因实验表明：DANCR可通过竞争性结合miR-33a-5p，上调酪氨酸激酶受体AXL的表达。此外，DANCR可增强AXL-Akt通路下游的蛋白质表达。DANCR在骨肉瘤组织中表达显著增加，且与肿瘤大小和转移呈正相关，是骨肉瘤不良预后的独立预测因子[33]。Min等[34]敲除DANCR后，U2OS细胞增殖速率显著减慢，且细胞周期被阻滞在G0/G1期，同时p21表达水平上调而CDK2表达水平下调，证明DANCR可能是一种致癌基因，它促进了骨肉瘤的增殖。

LncRNA TUG1也是一个在骨肉瘤中高表达的LncRNA。Zhang等[35]证明了敲除TUG1表达可以抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。其他研究则进一步证明：TUG1作为miR-335-5p[36]、miR-153[37]及miR-9-5p[38]的ceRNA提高了骨肉瘤细胞迁移能力和侵袭性。

LncRNA HOTAIR 在骨肉瘤细胞中高表达[39]。Li等[40]的实验结果表明： HOTAIR 通过 HOTAIR-miR126-DNMT1-CDKN2A轴来调节骨肉瘤细胞的活力和凋亡。 具体来说，HOTAIR通过抑制miR-126的表达来激活DNMT1。此外，HOTAIR通过DNA超甲基化失活CDKN2A启动子，从而抑制CDKN2A的表达。由此可见：HOTAIR 是一种致癌基因，能促进骨肉瘤细胞的增殖，抑制其凋亡[41]。

LncRNA tumor suppressor candidate 7 (TUSC7，又名LOC285194) 在骨肉瘤细胞中表达显著下调，过表达时可抑制骨肉瘤细胞增殖[42]。敲除成骨细胞中的TUSC7表达可抑制细胞凋亡，调节细胞周期相关基因，从而促进成骨细胞增殖。 TUSC7是一种由p53控制的肿瘤抑制因子，通过抑制mir-211而抑制细胞增殖[43]。而miR-211是一种内源性的Runx2 抑制剂，可抑制MSCs 成骨分化，促进MSCs向脂肪细胞分化[44]。

与骨肉瘤相关的LncRNA见表3。

表3 与骨肉瘤相关的LncRNA

4 结束语

本文综述了LncRNA在MSCs细胞干性维持及成骨、成脂分化过程中的调控作用及相关机制以及对骨肉瘤发生发展过程的影响。目前，LncRNA的研究还处于起步阶段，关于LncRNA参与MSCs细胞多向分化调控的研究还比较少，其机制也尚未阐明。但是从有限的报道中可以看出：LncRNA在MCSs增殖与分化平衡的调节中发挥了非常重要的作用，不但在MCSs干性维持和多向分化方面发挥至关重要的作用，而且与骨肉瘤的发生、发展密切相关。以DACER为例，DANCR可使MCSs细胞停留在未分化状态，当其下调时可促进MSCs成骨分化，在骨肉瘤组织中DANCR表达显著增加，且过表达的DANCR在体外可增加骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。这也从另一个角度证明增殖与分化的平衡可使MSCs发育成硬骨、软骨、脂肪或其他类型的细胞，当这一平衡被打破时，则可能产生骨肉瘤等疾病。

LncRNA 在肿瘤诊断、临床分期和预后判断等方面具有广阔的应用前景，也可能作为潜在的治疗靶点为新靶向药物开发提供依据。进一步明确LncRNA 调控MSCs增殖与分化的复杂信号网络，对于骨组织工程发展具有重要意义，也可为肿瘤治疗提供新的突破口。