中国小麦主产区品种主要春化基因的组成与分布

李 哲，杨 杰，李瑞博，王晓龙，张晓科，张玲丽

(西北农林科技大学 农学院，陕西 杨凌 712100)

小麦是我国分布最为广泛的粮食作物之一，在北纬22°～48°、海拔150～4 450 m的不同气候和耕作条件下均有种植[1-2]。春化特性是小麦适应不同气候条件的重要生理特性，影响小麦种植范围，也决定适宜播期[3-5]。小麦春化特性主要受春化基因控制，研究春化基因及其等位变异对小麦育种、引种和推广具有重要指导意义。

研究表明，小麦的春化特性受多个春化基因位点控制[6-8]，其中VRN-A1、VRN-B1、VRN-D1和VRN-B3是研究比较深入的4个主要春化基因。VRN-A1位点存在3种显性等位变异Vrn-A1a、Vrn-A1b和Vrn-A1c，其中Vrn-A1a对春化反应的影响最大，可完全消除春化需求[6]。VRN-B1位点至少存在3种显性等位变异Vrn-B1a、Vrn-B1b和Vrn-B1c。VRN-D1存在3种显性等位变异Vrn-D1a、Vrn-D1b和Vrn-D1c，显性等位变异赋予了小麦不同程度春性特点[8-13]。VRN-B3位点已发现了3种显性等位变异Vrn-B3a、Vrn-B3b和Vrn-B3c，其中Vrn-B3a和Vrn-B3c促进小麦提前抽穗开花，而Vrn-B3b推迟抽穗开花[9]。由此可知，不同位点不同等位变异春化基因对春化需求不同，决定了小麦冬春特性强弱差异，并通过不同等位变异组合调控小麦的春化发育特性[1-6,9-10]。中国幅员辽阔，南北气温差异、东西海拔差异很大，要求我国小麦品种对春化作用反应表型多样化，以适应复杂的环境条件，因此研究不同地区小麦春化基因组成具有重要意义。本研究利用4个主要春化基因VRN-A1、VRN-B1、VRN-D1和VRN-B3的相关分子标记，对中国小麦主产区品种的春化基因组成进行检测，分析其春化基因的等位变异组成特点及其在不同麦区的分布特征，旨在为我国小麦品种选育和推广提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为中国小麦主产区的国审和省审品种，共276份。其中，东北春麦区9份，北部冬麦区40份，黄淮冬麦区113份，长江中下游冬麦区51份，西北春麦区21份和西南冬麦区42份，所选品种基本代表了我国小麦育种和生产现状。

1.2 基因组DNA的提取

采用CTAB法[14]提取小麦幼苗叶片基因组DNA，每个品种提取3份DNA作为生物学重复，保证结果的可靠性。

1.3 序列标志位点(STS)分子标记检测及春化基因等位变异组成分析

春化位点检测引物设计参考Fu等[10]、Yan等[9]、Milec等[12]、Zhang等[13]和Chen等[11]，并由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体系为20 μL，其中基因组DNA 50 ng，10×buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，Taq酶0.5 U。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50～63 ℃退火30 s，72 ℃延伸42～126 s，35个循环；72 ℃延伸8 min。引物组合VRN1AF/VRN1-INT1R、Intr1/B/F、Intr1/B/R3和Intr1/B/R4的扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测(130 V电压电泳40～60 min)，其他引物组合的扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测(130 V电压电泳25～30 min)，缓冲体系为1×TAE溶液，EB染色，凝胶成像系统成像，然后统计结果，并分析各品种春化基因的等位变异类型。

2 结果与分析

2.1 春化基因各位点的等位变异组成

2.1.1VRN-A1位点 引物VRN1AF、VRN1-INT1R对VRN-A1位点的检测结果见图1。图1-A表明，德麦3号等20份材料扩增出965和876 bp 2条特异性条带，推断其VRN-A1位点为显性等位变异Vrn-A1a(占7.2%)；甘麦8号等11份材料扩增出714 bp特异性条带，说明VRN-A1位点为显性等位变异Vrn-A1b(占4.0 %)；其余245份材料均扩增出734 bp的特异性条带，表明VRN-A1位点可能含有隐性vrn-A1或显性Vrn-A1c等位变异。进一步用另外2对引物Intr1/C/F、Intr1/AB/R和Intr1/A/F2、Intr1/A/R3分别对上述245份材料进行检测，结果(图1-B)显示，只扩增出1 086 bp特异性条带，未扩增出1 170 bp特异性条带，说明其VRN-A1位点为隐性等位变异vrn-A1(占88.8%)。总体来看，VRN-A1位点隐性等位变异占88.8%；显性等位变异占11.2%，其中显性等位变异Vrn-A1a和Vrn-A1b分别占7.2%和4.0%。

2.1.2VRN-B1位点 利用引物Intr1/B/F、Intr1/B/R3和Intr1/B/R4的多重PCR体系，对VRN-B1位点进行检测，结果见图2。图2表明，鄂麦17等28份材料扩增出709 bp特异性条带，推断VRN-B1位点为显性等位变异Vrn-B1a(占10.1%)；郑麦9023等22份材料扩增出673 bp特异性条带，说明VRN-B1位点为显性等位变异Vrn-B1b(占8.0%)；其余226份材料扩增出1 149 bp特异性条带，表明VRN-B1位点为隐性等位变异vrn-B1(占81.9%)。总体来看，VRN-B1位点隐性等位变异占81.9%；显性等位变异占18.1%，其中显性等位变异Vrn-B1a和Vrn-B1b分别占10.1%和8.0%。

A.所用引物为VRN1AF与VRN1-INT1R；B.所用引物为Intr1/C/F与Intr1/AB/R；M.DL2000 Marker；1.德麦3号;2.J411;3.京冬8号；4.烟农18；5.辽春10号；6.靖麦7号；7.甘春20号;8.甘麦8号；9.中麦16；10.晋麦67；11.新春2号；12.新春26号A.The primers A are VRN1AF and VRN1-INT1R;B.The primers are Intr1/C/F and Intr1/AB/R;M.DL2000 Marker；1.Demai 3;2.J411;3Jingdong 8；4.Yannong 18；5.Liaochun 10；6.Jingmai 7；7.Ganchun 20;8.Ganmai 8；9.Zhongmai 16；10.Jingmai 67；11.Xinchun 2；12.Xinchun 26图1 部分参试小麦品种VRN-A1位点的扩增结果Fig.1 PCR amplification fragments at VRN-A1 locus in several wheat cultivars

M.DL2000 Marker；1.中麦16；2.R57;3.云麦39；4.川育12；5.北麦10；6.陇春20；7.新春6号；8.鄂恩6号；9.石4158；10.鄂麦17；11.郑麦9023；12.鲁麦23M.DL2000 Marker；1.Zhongmai16；2.R57;3.Yunmai 39；4.Chuanyu 12；5.Beimai 10；6.Longchun 20；7.Xinchun 6；8.Een 6；9.Shi 4158；10.Emai 17；11.Zhengmai 9023；12.Lumai 23.图2 部分参试小麦品种VRN-B1位点的扩增结果Fig.2 PCR amplification fragments at VRN-B1 locus in several wheat cultivars

2.1.3VRN-D1位点 利用引物Intrl/D/F、Intrl/D/R3和Intr1/D/R4的多重PCR体系，对VRN-D1位点进行检测，结果表明，川麦47等120个品种扩增出1 671 bp特异性条带，推断VRN-D1位点为显性等位变异；进一步利用互补性标记(VRN1DF/VRN1-SNP161CR和VRN1DF/VRN1-SNP161A-R)对这120份VRN-D1显性等位变异类型进行检测，其中111份材料为Vrn-D1a显性等位变异(40.2%)，9份材料为Vrn-D1b显性等位变异(占3.3%)。其余156个品种扩增出997 bp特异性条带，说明这些品种可能含有隐性vrn-D1或显性Vrn-D1c等位变异，再利用引物VRN1DF/VRN1-SNP161CR对这156份材料进一步检测，结果(图3)发现，襄麦25等3个品种扩增出787 bp特异性条带，说明这些材料为显性等位变异Vrn-D1c(占1.1%)，而周麦16等153份材料扩增出612 bp特异性条带，说明这些材料为隐性等位变异vrn-D1(占55.4%)。总体来看，VRN-D1位点隐性等位变异占55.4%；显性等位变异占44.6%，其中显性等位变异Vrn-D1a、Vrn-D1b和Vrn-D1c分别占40.2%，3.3%和1.1%。

所用引物为VRN1DF与VRN1-SNP161CR；M.DL2000 Marker；1.丰抗2号；2.淮麦18；3.豫麦57；4.襄麦25；5.皖麦19；6.豫麦50；7.周麦16；8.泰山1号；9.繁105；10.龙辐麦17；11.甘春16号；12.变异4号The primers are VRN1DF and VRN1-SNP161CR；M.DL2000 Marker；1.Fengkang 2；2.Huaimai 18；3.Yumai 57；4.Xiangmai 25；5.Wanmai 19；6.Yumai 50；7.Zhoumai 16；8.Taishan 1；9.Fan 105；10.Longfumai 17；11.Ganchun 16；12.Bianyi 4图3 部分参试小麦品种VRN-D1位点的扩增结果Fig.3 PCR amplification fragments at VRN-D1 locus in several wheat cultivars

2.1.4VRN-B3位点 利用引物VRN4-B-INS-F和VRN4-B-INS-R对VRN-B3位点进行检测，结果表明，仅辽春10号扩增出1 200 bp特异性条带，说明该品种为显性等位变异Vrn-B3a(占0.4%)；利用引物VRN4-B-NOINS-F和VRN4-B-NOINS-R对其余的275个品种检测，结果(图4)发现，仅短红芒麦品种扩增出2 030 bp特异性条带，为显性等位变异Vrn-B3b(占0.4%)，其余274个品种扩增出1 140 bp特异性条带，为隐性等位变异vrn-B3(占99.2%)。总体来看，VRN-B3位点隐性等位变异占99.2%；显性等位变异占0.8%，其中显性等位变异Vrn-B3a和Vrn-B3b均占0.4%。

所用引物为VRN4-B-NOINS-F 与VRN4-B-NOINS-R；M.DL2000 Marker；1.小偃54；2.短红芒麦；3.冀麦38；4.荔垦2号；5.西农336；6.济南17；7.碧蚂4号；8.蚰子麦；9.扬麦158；10.川麦42；11.墨沙；12.南原1号The primers are VRN4-B-NOINS-F and VRN4-B-NOINS-R；M.DL2000 Marker；1.Xiaoyan 54；2.Duanhongmangmai；3.Jimai 38；4.Liken 2；5.Xinong 336；6.Jinan 17；7.Bima 4；8.Youzimai；9.Yangmai 158；10.Chuanmai 42；11.Mosha；12.Nanyuan 1图4 部分参试小麦品种VRN-B3位点的扩增结果Fig.4 PCR amplification fragments at VRN-B3 locus in several wheat cultivars

2.2 春化基因各位点等位变异在不同麦区的分布特点

在276份品种中，4个主要春化基因位点之间显性等位变异的分布频率不同，由高到低的顺序为VRN-D1(44.6%)>VRN-B1(18.1%)>VRN-A1(11.2%)>VRN-B3(0.8%)。4个主要春化基因位点显性等位变异在不同麦区的分布频率见表1。

表1 4个主要春化基因位点显性等位变异在不同麦区的分布频率Table 1 Distribution of allele at four loci of vernalization genes in different wheat regions

注：Ⅰ.北部冬麦区；Ⅱ.黄淮冬麦区；Ⅲ.长江中下游冬麦区；Ⅳ.西南冬麦区；Ⅴ.东北春麦区；Ⅵ.西北春麦区。下同。
Note:Ⅰ.Northern winter wheat region；Ⅱ.Huanghuai winter wheat region；Ⅲ.Yangzi River winter wheat region；Ⅳ.Southwestern winter wheat region；Ⅴ.Northeastern spring wheat region；Ⅵ.Northwestern spring wheat region.The same below.

由图1可知，春化基因在各麦区中的分布频率有很大差异，其中显性等位变异Vrn-A1分布频率从高到低依次为东北春麦区(100.0%)>西北春麦区(76.2%) >西南冬麦区(7.1%)>长江中下游冬麦区(5.9%)>北部冬麦区(0.0%)=黄淮冬麦区(0.0%)；显性等位变异VRN-B1分布频率依次为东北春麦区(88.9%)>西北春麦区(66.7%)>西南冬麦区(35.7%)>黄淮冬麦区(8.8%) >长江中下游冬麦区(5.9%)>北部冬麦区(0.0%)；显性等位变异VRN-D1分布频率依次为长江中下游冬麦区(92.2%)>西南冬麦区(88.1%)>东北春麦区(66.7%)>西北春麦区(33.3%)>黄淮冬麦区(23.0%)>北部冬麦区(0%)；276份小麦品种中VRN-B3主要以隐性等位变异类型vrn-B3组成(99.2%)，其显性等位变异类型分布很少。

2.3 春化基因等位变异的组合及其分布特点

在276份小麦品种中，4个春化基因位点共存在9种等位变异组合类型(表2)，不同等位变异组合类型的总体分布比例不同，以vrn-A1/vrn-B1/VRN-D1/vrn-B3组合类型比例最高(33.7%)。不同等位变异组合类型在各麦区中的分布频率也有很大差异，其中北部冬麦区品种的春化基因全部为隐性等位变异组合类型；在黄淮冬麦区、长江中下游冬麦区和西南冬麦区中，VRN-D1位点为显性等位变异的组合类型在品种内占主导地位；在东北春麦区和西北春麦区，品种的春化基因组合主要以VRN-A1和VRN-B1位点同时为显性等位变异的组合形式存在。

表2 4个主要春化基因位点不同等位变异组合的分布频率Table 2 Distribution of allelic combination at four loci of vernalization genes %

3 讨 论

依据自然条件、耕作特点及小麦的生态型等，我国小麦种植区域被划分为10个麦区[15]。不同麦区小麦品种的春化基因组成差异反映了不同环境对品种春化特性的要求，是小麦环境适应性的分子基础。小麦的春化特性受多基因调控的复杂生理过程决定[3-5]，其中显性春化基因VRN-A1、VRN-B1、VRN-D1对低温春化的要求不同，携带VRN-A1的小麦品种不需要春化就能抽穗开花，携带VRN-D1的小麦品种需要一定春化作用，VRN-B1介于两者之间[16]。本研究结果表明，我国小麦品种春化基因显性等位变异中VRN-D1所占比例(44.6%)最高，并在6大麦区均有分布，表明在中国小麦品种中控制春化特性的主要是对春化作用需求较强的VRN-D1；而不需要春化作用的显性等位变异VRN-A1主要分布在东北春麦区和西北春麦区；需求较弱的VRN-B1，除北部冬麦区外均有分布，分布比例由低纬度向高纬度递增。与姜莹等[17]研究结果不同的是，本研究长江中下游冬麦区品种出现了VRN-A1和VRN-B1位点的显性等位变异，比例均为5.9%；黄淮冬麦区品种出现了VRN-B1位点显性等位变异品种，分布频率为8.8%，说明近年来随着气候变暖，显性春化基因VRN-A1和VRN-B1可能通过后期育种已导入到了这些地区的小麦品种内。

冬小麦是我国最主要的小麦类型。对于年平均和年极端温度低、冬季最冷月(1月)平均气温低和无霜期较短的地区，秋播小麦无法安全越冬，需要种植春小麦。与冬小麦相比，春小麦生育期短，苗期温度较高或低温时间较短，因此春麦区需要种植春性较强的品种。从6个麦区小麦生产实践来看[18]，东北春麦区(生育期75～95 d)和西北春麦区(生育期100～130 d)等春麦区小麦生育期较短，并随纬度增高而变短；长江中下游冬麦区(生育期181～218 d)、西南冬麦区(生育期180～220 d)、黄淮冬麦区(生育期225～260 d)、北部冬麦区(生育期270～280 d)等冬麦区小麦生育期相对较长，并随纬度增高而延长。小麦为了适应地区气候等条件要求，春化基因组成表现出相应特点。在东北春麦区和西北春麦区，品种多以对春化作用不敏感的VRN-A1和VRN-B1位点的显性等位变异组合为主，比例大体随着纬度的增大而增加，品种春性特性增强，与生育期缩短相吻合。在黄淮冬麦区、西南冬麦区和长江中下游冬麦区，品种春化基因组成类型以对春化需求较弱的VRN-D1位点显性等位变异占主导地位，并随纬度增高而递减，品种冬性逐渐增加，抗冬性增强，生育期延长。

因分子标记限制，本研究只完成了我国主产麦区小麦品种春化基因VRN-A1、VRN-B1、VRN-D1、VRN-B3位点组成分析，随着其他春化基因如VRN2和VRN4位点研究的深入，对这些位点基因组成进行分析，将可全面解释我国小麦对春化反应的分子组成特点，更好地为小麦育种和推广提供理论依据。