羊腹腔镜深部授精技术的应用*

崔北亮 ，石国庆 ，万鹏程 ，倪建宏 ，刘长彬 *

（1.新疆生产建设兵团第九师一六一团畜牧兽医工作站，新疆 裕民县 834800；2.省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院畜牧兽医研究所）

腹腔镜技术亦有人称之为“钥匙孔”技术，是一门新发展起来的微创方法，是人、畜未来手术方法发展的一个必然趋势。随着高精端工业制造技术的进步，多学科的交叉融合，为新方法、新技术奠定了坚实的基础，加上技术人员的娴熟操作，越来越多的开放性手术已被腹腔镜技术取而代之，为微创手术增加了选择机会。

人工授精技术最早在1780年由意大利生理学家L.Spallanzani在狗上获得成功。俄国学者E.I.Ivanoff在1900年分别在马、牛和绵羊上获得成功。20世纪30年代开始，人工授精技术逐步成熟，开始由实验室走向生产实践。1936年丹麦成立了第一个人工授精协会。1938年美国成立了第一个人工授精合作会。20世纪40年代，人工授精技术在世界范围内得到迅速的推广和应用。畜牧业发达国家如美国、英国、加拿大和日本等国开始普及牛的人工授精技术，且具有非常大的应用规模。我国近30年来，无论在人工授精规模、品种和范围上都取得了长足的发展。人工授精技术和冷冻精液的应用在中国荷斯坦奶牛的培育中起到了举足轻重的作用。随着我国舍饲畜牧业的大发展，在规模化养猪场、羊场、鸡场和特种动物养殖场等地方人工授精技术显得越来越迫切[1-3]。

腹腔镜是用于腹腔内检查和治疗的内窥镜，其实质上是一种纤维光源内窥镜，包括腹腔镜镜头、光源系统和光导纤维。运用腹腔镜系统技术，可通过腹腔镜镜头直接观察到腹腔内的情况，施行精确操作，具有手术时间短、创口小、并发症少、安全、恢复快等优点。近年来，腹腔镜技术发展迅速，既可用于检查，亦可用于治疗，是目前世界上最先进、最尖端的微创技术，在治疗外科疾病中的作用已受到越来越多人的瞩目。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 冷冻精液来源

冻精采自白萨福克肉羊，自行通过卡苏冻精设备生产。

1.1.2 受体羊

受体羊为2～5岁或生产过1胎、生殖系统健康及无传染病的湖羊。

1.1.3 供试器材

拥有自主知识产权的羊胚胎移植架、子宫角输精枪（德国）、腹腔镜（Wolf，德国）、恒温水浴锅、打孔器、显微镜（国产）、CO2钢瓶（国产）、持针钳、缝合针及线、工作服、液氮罐、液氮、注射器（5 mL）、温度计、碘酒及酒精、新吉尔灭消毒液、抽纸、耳标等主要实验器材及耗材。

1.1.4 供试药品

进口海绵栓、孕马血清促性腺激素、青霉素等。

1.2 试验方法

1.2.1 受体羊同期发情处理

受体羊同期发情采用阴道海绵栓处理法，将进口海绵栓通过海绵栓放置器放入母羊阴道深部，放置当天设为0 d，第11～13天撤除海绵栓，同时肌肉注射PMSG 250～330 IU，撤栓后24～48 h进行受体羊试情，并做好标记，记录发情日期，受体羊断食断水，等待输精。

1.2.2 冻精质量鉴定

将冷冻好的细管精液在水浴锅内（37℃）放置10～30 s解冻，解冻后取出并及时将细管上的水珠擦拭干净，剪去一端，将少量解冻好的精液推至载玻片上，并盖上盖玻片，放置在显微镜物镜上，调整光源，观察精子活力，精子活力在0.3以上即可用于输精。

1.2.3 妊娠检查

于胚胎移植后的45～60 d进行B超检查，统计受胎率。

1.2.4 统计与分析

试验数据采用卡方检验进行差异显著分析。

2 结果与分析

2.1 湖羊同期发情率

湖羊是常年发情，且具有明显的多胎优势。本试验采用进口海绵栓＋PMSG的处理技术，埋栓时长为11 d，在第11天肌肉注射PMSG 330 IU，取得较好的同期化发情效果（见表1）。

表1 试验湖羊海绵栓+PMSG同期化发情效果

2.2 湖羊腹腔镜输精受胎率

表2 试验湖羊腹腔镜输精情期受胎率

传统的阴道输精情期受胎率较低，一般在45%～55%之间，而腹腔镜输精大大提高了人工授精的受胎率，一般为70%左右，最高可达90%以上。本试验采用腹腔镜输精技术共计2批次输精118只湖羊，受胎率平均达到了90%以上（见表2）。

3 讨论

3.1 不同同期化发情处理方法的同期效果

20世纪80年代，我国开始绵羊同期发情技术和推广的研究应用。1980年，张儒学用MAP（甲孕酮）＋FSH（促卵泡生成素）＋LH（促黄体素）进行绵羊同期发情试验研究，MAP用量为60mg，埋植时间为16 d，第16天撤栓同时肌肉注射FSH 30～35 IU，8 h后肌肉注射LH 15～22 IU，同期发情率100%，受胎率78%，产羔率142%。1983年，王茂采用PG（氯前列烯醇）＋ICT（三合激素）进行同期发情试验研究，也取得了成功。1987年，林子忠等采用皮下埋植法，获得80%的同期发情率。1989年，陈家振用孕激素＋PGF2a＋PMSG的处理方法，即孕酮肌肉注射7～9 d，再注射PGF2a和PMSG，获得了86%的同期发情率。20世纪90年代以来，随着绵羊同期发情技术的成熟，以及新药品的层出不穷和研究的深入。目前，最常用的埋植方法有栓剂阴道埋植和皮下埋植，常用的缓释产品有海绵栓、硅胶栓等[7-9]。另外，还有以黄体溶解达到发情的方法，主要是氯前列烯醇法[10-13]。

本试验研究采用海绵栓＋PMSG和PG法进行对比，从数据可以看出，海绵栓＋PMSG的同期发情处理方法达到较高的同期发情率，差异显著 （P＜0.05）。为了降低生产成本，增加生产效益，本试验没有注射LH激素，同样取得了较为整齐和较高的同期率，可以在规模化羊场中推广应用。

同期发情效果的成功与否直接影响输精效果，主要体现在两个方面，一是羊同期发情率不高，能够达到输精标准的不多；二是同期发情的目的就是达到发情整齐。如果羊发情不整齐，同一时间输精后，就达不到预期的受胎效果。

3.2 腹腔镜深部授精与传统授精效果比较

腹腔镜技术在动物中的应用主要集中在辅助人工授精。20世纪80年代Morcom等将腹腔镜技术运用到猪的输卵管人工授精上，之后有研究将腹腔镜技术用在羊的人工授精上，并取得了成功，提高了母羊的情期受胎率。Fantinati P等报道，采用腹腔镜技术授精，能够减少输精量，且不影响受胎率。随着腹腔镜技术的不断发展，腹腔镜技术的应用范围越来越广阔。Besenfelder U等在家兔上采用腹腔镜技术初步进行了胚胎移植，移植过程方便、快捷，动物的手术应激反应明显减少，还有人尝试用腹腔镜技术对家兔进行了取卵操作，该技术的成熟和应用为体外受精、转基因研究等提供了方便[14-16]。

本试验采用腹腔镜深部输精技术，与传统的阴道输精比较，腹腔镜输精能够获得较高的情期受胎率（90%以上），与传统的输精方式相比差异极显著（P<0.01）。

腹腔镜深部授精技术优势明显，主要体现在：一是减少了公羊试情；二是减少了观察和抓羊的人力；三是减少了输精时根据阴道粘液分泌物特性来判断羊是否发情的麻烦；四是减少了人为判断失误的情况发生；五是与传统的输精方法相比，腹腔镜授精具有明显的优势和较高的情期受胎率。

4 腹腔镜技术应用前景

目前，腹腔镜技术在畜牧业中的应用相对滞后，主要集中在羊的人工授精、胚胎移植、卵巢表面活动规律变化观察等方面，究其原因可能与畜牧技术员对腹腔镜的作用认识不够和不全有关，以及设备费用较贵等原因导致。随着科研投入的不断加大，技术人员对腹腔镜技术的熟练掌握，腹腔镜技术以其独有的创伤小、恢复快、刺激性小等优势，在羊人工授精、胚胎移植和卵巢活动观察等手术中一定会突显出来，其必定会被广泛应用于兽医临床诊疗、动物繁殖育种及生物工程等生命科学领域。