赣南地区碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌的基因型研究

欧阳琳，谢丽，钟贞玲

（兴国县人民医院检验科，江西 赣州 342400）

阴沟肠杆菌是一种重要条件致病菌，广泛存在于自然界中，随着头孢菌素临床广泛使用，日益成为医院感染重要病原菌[1]。碳青霉烯类抗生素是一类非典型β-内酰胺抗生素，抗菌谱广泛，抗菌活性强，安全性高[2]。由于临床治疗中碳青霉烯类抗生素不规范使用，部分阴沟肠杆菌出现耐药趋势，严重影响临床抗感染工作[3]。为了解赣南地区碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌的基因型，本研究选取2015年9月～2016年9月赣南地区5所综合性医院分离的60株碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌，采用生物分子技术进行研究。

1 材料与方法

1.1 菌株来源与鉴定 收集2015年9月～2016年9月赣南地区5所综合性医院分离的碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌共60株。质控菌采用大肠埃希菌（ATCC25922）与产酸克雷伯菌（ATCC700324）。

1.2 药物敏感性试验 采用微量肉汤法对纳入菌株进行药敏测试，观察纳入菌株对亚胺培南、美罗培南、厄他培南、阿莫西林、阿莫新林/克拉维酸、哌拉西林、哌拉西林/他挫巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉维酸、头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢替坦、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、复方新诺明、环丙沙星等19种抗菌药物的耐药情况。测定结果参考美国临床和实验室标准协会标准（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）[4]。

1.3 改良Hodge实验 使用无菌生理盐水将待检阴沟肠杆菌稀释后涂抹于MH琼脂平板，将美罗培南纸片贴于MH琼脂平板，从纸片边缘放射状划线，放入孵育箱，24 h后取出判读结果，美罗培南抑菌圈内出现待检阴沟肠杆菌矢状生长增强者即可判读为阳性。

1.4 基因检测 采用聚合酶链式反应（PCR）法检测耐药菌株中编码碳青霉烯酶（NDM型、IMP型、VIM型、KPC型）及超广谱β-内酰胺酶（CTX-M-1型、CTX-M-2型、CTX-M-9型）耐药基因。结果与GenBank序列（BLAST）进行比较分析，鉴定碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌基因类型。

2 结果

2.1 60株碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌对抗菌药物的药敏率 60株碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗生素亚胺培南、美罗培南、厄他培南均具有较高耐药性，耐药率≥90.0%；对阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星、复方新诺明、庆大霉素耐药性较低，耐药率在25.0%～53.3%，见表1。

表1 60株碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌对抗菌药物的药敏率Table 1 60 antimicrobial susceptibility of carbapenem resistant Enterobacter cloacae

2.2 基因检测结果 60株碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌中，51株检测出携带碳青霉烯酶基因，检出率为85.0%，包括NMD型18株（20.0%）、IMP型22株（36.7%）、KPC型13株（21.7%），其中NMD型合并IMP型2株（3.3%），见表2。

表2 60株株碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌基因检测结果Table 2 60 gene detection results of carbapenem resistant Enterobacter cloacae strains

3 讨论

阴沟肠杆菌是革兰阴性粗短杆菌，广泛存在于土壤、水体、植物等自然界中，在人体肠道内也可检测出阴沟肠杆菌[5]。碳青霉烯类抗菌药物是一类非典型β-内酰胺抗生素，化学结构与青霉素类青霉环相似，但与青霉素顺式构象，具有广泛抗菌谱、极强抗菌活性、高度稳定性，可以抑制细胞壁站台合成酶，破坏细菌胞壁，溶解杀灭细菌，同时对细菌有选择性抑制杀灭作用，毒副反应较小[6]。目前临床常用碳青霉烯类抗生素包括亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、厄他培南、比阿培南、多尼培南等[7]。随着广谱抗菌药物广泛使用，部分阴沟肠杆菌出现碳青霉烯类耐药现象，给临床抗感染治疗工作带来巨大挑战。

近年来研究显示，碳青霉烯耐药机制主要为产碳青霉烯酶与超广谱β-内酰胺酶[8]。产碳青霉烯酶指可以水解亚胺培南或美罗培南的β-内酰胺酶，根据Ambler分子分型可分为A类丝氨酸酶、B类金属酶、D类丝氨酸酶，其中B类金属酶是产碳青霉烯酶主要类型，较其他广谱β-内酰胺酶具有更高水解活力[9]。B类金属酶即金属β-内酰胺酶，多来自于自然界中微生物，常见于铜绿假单胞菌、肠杆菌科细菌、不动杆菌属，可由细菌染色体DNA编码，能对黄杆菌、芽孢杆菌、脆弱拟杆菌等单胞菌属产生耐药作用，尤其可以使肠杆菌获得碳青霉烯酶类抗生素耐药性[10]。迄今实验研究已发现9种B类金属酶，分别为KHM酶、SPM酶、GIM酶、DIM酶、AIM酶、VIM酶、IMP酶、NDM酶、SIM酶，在临床中最为常见的基因型为SPM酶、VIM酶、IMP酶、NDM酶[11]。SPM酶目前主要见于南美绿脓杆菌，我国出现较少[12]。相关研究显示，VIM酶可以使肠杆菌产生较高耐药性[13]。NDM酶是新近检测到的可获得性B类金属酶，最早在肺炎克雷伯杆菌中发现，在全球范围内均有一定报道，具有较强传播能力，在临床抗感染治疗中得到越来越多重视[14]。IMP酶是最早发现的B类金属酶，在多种肠杆菌中检测出现，尤其是不动杆菌与绿假单胞菌。IMP酶具有多种亚型，具有较强传播能力，可水解碳青霉烯类抗生素，但对替莫西林耐药作用[15]。KPC酶是A类丝氨酸酶，最早在肺炎克雷伯杆菌中发现，表现出高度亚胺培南与美罗培南耐药性，传播机制目前尚不明确，可合并肠杆菌科、铜绿假单细胞菌、不动杆菌属膜孔蛋白，致菌株产生碳青霉烯类抗生素耐药性。KPC酶不仅在美洲各地传播蔓延，近年来在我国也有一定报告发现，逐渐成为我国公共卫生健康安全重大问题[16]。本次调查研究显示，60株碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌中，51株检测出携带碳青霉烯酶基因，NMD酶、IMP酶、KPC酶是引起阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要原因。超广谱β-内酰胺酶是一类β-内酰胺酶，主要由质粒介导，对青霉素、头孢菌素、氨曲南等氧亚氨基β-内酰胺类抗生素具有水解活性，常见于大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、不动杆菌等。CTX-M酶是流行最广的超广谱β-内酰胺酶，主要见于大肠埃希菌、产期肠杆菌等，对窄谱头孢菌素具有极强水解活性。相关研究显示，CTX-M酶可致部分肠杆菌产生碳青霉烯耐药性[17]。本研究60株碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌共检出9例阳性CTX-M酶，提示CTX-M酶也可能导致阴沟肠杆菌碳青霉烯类抗生素耐药性。

综上所述，NMD酶、IMP酶、KPC酶为碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌主要基因类型，CTX-M酶也可能对阴沟肠杆菌碳青霉烯类耐药性产生一定影响。