microRNA在肥胖相关肾病发生的临床应用△

崔胜金 陈泽衍 郭伟权 周义文

(南方医科大学深圳医院 深圳 518101)

肥胖相关性肾病是临床常见的肾病类型，各年龄段均可发病，青壮年多发，相关数据显示70%患者发病年龄在44岁以下，且男性患者发病率略高于女性，患者患病后除了有明显蛋白尿，同时存在肾小球肥大或硬化情况[1～2]。目前临床主要通过药物改善患者肾脏功能、控制病情发展，近几年临床一直在研究疾病发病机制，希望从中找到防治疾病的靶点，并通过药物靶点作用达到治疗效果。miR是一种RNA在生物体的器官形成、细胞增殖、凋亡及部分疾病的发生中发挥作用[3]。在相关研究中miR-192在肾脏组织中高表达，且糖尿病肾病(DA)者纤维化肾小球中miR-192表达水平显著低于无纤维化组织，其认为miR-192可能参与DA发病，故临床认为miR可能在肾病发生中发挥作用。CTNNBIPl是一种结合蛋白，有研究表明其使信号转导的关键分子，能与Tcf/fLef转录因子及转录共激活子CPB/p300竞争性地与β-catenin结合，从而调控相关信号途径。本文通过观察db/db小鼠肾组织中miR-215表达，查询其调控的靶基因，证实其与靶基因的关系，观察靶基因表达，从而分析miR在疾病发生中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1实验试剂

miR-215模拟物及对照，羊抗ICAT抗体(CTNNBIP1)，Cy3标记的miR阴性对照，小鼠抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的抗羊IgG和抗生物素-辣根过氧化物酶抗体，实时定量 PCR试剂盒、荧光素酶报告基因载体pmiR-REPORT质粒等。

1.1.2实验物

雄性小鼠36只(实验动物中心提供 SPF级)，其中db/m小鼠、db/db小鼠各18只，且均为4周龄。

1.2 方法

1.2.1实验物处理

两组小鼠均于SPF清洁级层流室中饲养，小鼠可自由进食、进水，于小鼠8、12、16周龄时，随机在两组各抽6只处死，开腹取出肾脏，清除肾门处血管等结缔组织，将肾组织以液氮保存。

1.2.2miR-215靶基因预测

使用Targetscan、Pictar及和miRNA.org预测软件对miR-215靶基因进行预测，找出3个软件预测交集的靶基因，并通过过GO注释分析靶基因的生物学功能，进而找出相关靶基因。

1.2.3构建miR-CTNNBIPl-3'UTR质粒

参考Targetscan软件中CTNNBIPl-3'UTR序列，以Primer Premier0软件对成PCR引物进行设计合成，将限制性内切酶SpeI(ACTAGT)与HindⅢ(AAGCTT)识别位点分别加入上、下游引物中，序列为5'-GCGCACTAGTTCTTGACCAACGGAAAC-3'，5'-GCGCAAGCTTACCTACAGCCAATCAAAG-3'。提取培养MMC RNA，并在反转录后将可能与miR-215序列结合的位点片段，行CTNNBIPl-3'UTR PCR扩增，扩增后与Spe I与Hind Ⅲ双酶切pmiR-REPORT载体相连。转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，提取质粒，并以Spe I、HindⅢ双酶切鉴定，将鉴定正确的质粒进行克隆测序，选择其中测序正确的质粒，完成miR-CTNNBIPl-3'UTR质粒的构建。

1.2.4测双荧光素酶活性

对细胞进行培养，选择处于对数生长期细胞接种，在细胞密度达到50%～70%后行基因转染，将转染剂分别加入4组中，1组(pmiR-REPORT+pRL-TK质粒+miR-control)、两组(pmiR-REPORT+pRL-TK质粒+miR-215 mimics)、3组(pmiR-CTNNBIPl-3'UTR+pRL-TK质粒+miR-control)、4组(pmiR-CTNNBIPl-3'UTR+pRL-TK质粒+miR-215 mimics)，转染1d后测酶活性，以萤火虫与海肾荧光活性的比值表示相对荧光素酶活性。

1.2.5PCR法

小鼠肾脏组织RNA提取按照Trizol说明书行肾组织RNA提取，应用超微量分光光度计测定核酸浓度，取等量0.5μl RNA按试剂盒说明书行反转录，以采用PCR系统行实时荧光定量PCR反应，结束后行熔解曲线分析，确定PCR扩增特异性，得出的ct值并按公式求出基因表达的相对变化量，重复3次。

1.2.6Westernblot法

根据SP免疫组织化学检测试剂盒说明书进行操作，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 观察指标

观察两组小鼠小鼠肾组织中miR-215、CTNNBIPl的表达变化情况。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 两组miR-215、CTNNBIPl水平表达

结果显示观察组小鼠随着周龄增加组织中miR-215表达上升，P<0.05；对照组无明显变化，同时随着周龄增加观察组CTNNBIPl表达下降，P<0.05，见图1。

2.2 miR-215、CTNNBIPl的关系

结果显示4组荧光素酶相对活性低于其他3组，4组荧光表达强度低，P<0.05，见图2。

图2 荧光素酶活性

3 讨论

miR是一类具有高度保守表达的新型RNA片段，其通过与基因mRNA的3'-UTR碱基互补配对结合，从而对基因mRNA特性进行降解，进而参与调控下游靶基因表达，临床认为通过对这些能特异性表达的miR进行分析，能对一些疾病防治起到重要作用[5]。肥胖相关性肾病是临床一种因患者肥胖所引发的肾脏疾病，特征为持续性蛋白尿、肾小球滤过率增高，疾病可致患者肾小球病变(单纯肥大、硬化)，若不及时治疗患者预后较差，5 年肾存活率仅为77%，10 年为51%，因此如何有效防治疾病得到临床的重视[6]。

早前有学者发现miR-192在肾脏组织中能特异性表达，其通过调控靶基因SIPl、ZEBI表达，来参与肾小球系膜细胞细胞外基质的过度积聚的过程，其水平高度表达有促肾小球硬化、肾间质纤维化的作用[7]。miR-215与miR-192具有共同的“种子序列”，故推测其可能具有与miR-192相似的病理作用，本次结果显示小鼠肥胖相关性肾病形成过程中，观察组肾组织miR-215表达上升，呈明显的时间依赖性，且与对照组miR-215表达有明显差异，提示miR参与肥胖相关性肾病的形成[8]。同时通过用生物信息学分析，其相关调控靶基因为CTNNBIPl，CTNNBIPl是一种结合蛋白，有研究表明其是信号转导的关键分子，能通过竞争性地与β-catenin结合，对Wnt-β-catenin信号途径进行负性调控，而Wnt-β-catenin途径下游靶基因与肾小球纤维化机制、系膜细胞表型转化的启动、维持密切相关，故临床认为miR可能通过调节CTNNBIPl来参与疾病的发生、发展[9]。

本次结果显示随着周龄增加观察组CTNNBIPl表达下降，且与对照组CTNNBIPl表达有明显差异，同时双荧光素酶实验显示。转染miR-215可抑制基因荧光素酶的表达活性，提示CTNNBIPl的表达受到miR-215负性调控，随着miR-215表达上调，CTNNBIPl表达逐渐下降，从而使肥胖性肾病患者病程中Wnt-β-catenin途径处于激活状态，进而促纤维细胞因子表达，临床表现为肾小球的逐渐硬化[10]。

综上所述，miR-215可能通过调控CTNNBIPl靶基因表达，从而参与肥胖相关性肾病的形成，本实验结果仍有待进一步深入研究，若得到证实miR-215可能成为早期疾病诊断、判断预后的有效标志物。