延胡索中海罂粟碱和去氢延胡索甲素制备工艺的研究

欧丽婷，丁 辉，吕菲菲，张朝凤，张 勉，许翔鸿

(中国药科大学 中药学院 生药学研究室，江苏 南京211198)

延胡索为罂粟科紫堇属植物延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang) 的干燥块茎，作为著名的浙江道地药材“浙八味”之一，它是临床上常用的中药。其性辛温味苦，无毒，具有活血、行气、止痛的功效，为历版《中国药典》所收载[1]。

延胡索主要活性成分是异喹啉生物碱，母核类型多样，主要的有原小檗碱(protoberberine)型如原小檗碱型的延胡索甲素(corydaline，Cor)、四氢巴马汀(tetrahydropalmatine，THP即延胡索乙素)、去氢延胡索甲素(dehydrocorydaline，DHC)；普洛托品(protopine)型如原阿品碱(protopine)、阿朴菲型(aporphine) 如海罂粟碱(glaucine)[2]。其中多个生物碱已被开发为不同作用的制剂，延胡索乙素在中国作为止痛药[3]，去氢延胡索甲素作为抑制胃酸分泌的抗溃疡剂[4]，以“Egnosin”的商品名在日本市场销售[5]，海罂粟碱具有支气管扩张和抗炎作用[6]，自1967年开始在罗马尼亚和保加利亚等欧盟的一些国家用作镇咳药使用[7-8]。

基于延胡索不同生物碱单体的现实需求，需要开发出一种快速简单、适合工业化生产单体化合物的方法，特别是已有临床应用的海罂粟碱和去氢延胡索甲素。传统分离方法是基于研究目的的硅胶柱层析分离方法[9]，很难工业化生产；虽然有报道用高速逆流色谱法分离制备延胡索中的海罂粟碱和去氢延胡索甲素[10]，但是此方法工艺复杂，也无法量产。本文首次提出通过不同的pH梯度结合不同类型溶剂萃取，可以快速大量得到海罂粟碱和去氢延胡索甲素的方法。此方法适合于工业化生产海罂粟碱和去氢延胡索甲素，也适用于延胡索中其他结构相似的生物碱工业化生产方法的开发。

1 仪器与试药

Agilent 1260系列高效液相色谱仪(Agilent Technologies, USA)；AL104万分之一分析天平、XS105DU十万分之一分析天平(Mettler-Toledo Balances & Scales for Industry, Switzerland)；N-1100 型旋转蒸发仪(Tokyo Rikakikai, Co.,Ltd, Japan)；KH-500DE医用数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；数显恒温水浴锅(江苏常州国华仪器厂)；高速多功能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。

延胡索甲素、延胡索乙素、去氢延胡索甲素和海罂粟碱对照品自制，纯度大于99%(HPLC面积归一化法)。延胡索药材2016年购自安徽亳州药材市场，经作者鉴定、导师核对为罂粟科植物延胡索的干燥块茎。甲醇为色谱纯(美国TEDIA)，水为哇哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 延胡索提取方法

取延胡索药材粉碎，用8倍量80%乙醇回流提取两次，每次1.5 h。滤过，提取液合并，减压浓缩得浸膏，干燥，备用。

2.2 HPLC含量测定色谱条件

Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；以0.15%乙酸铵水(A)-甲醇(B)为流动相梯度洗脱： 0～3 min，维持45% B；3～15 min，45%～75% B；15～22 min，维持75% B；22～29 min，75%～85% B；29～34 min, 维持85% B；34～39 min，85%～95% B；检测波长为280 nm，流速1 mL /min，柱温30 ℃，进样量10 μL。(方法学考察略)

2.3 生物碱萃取方法

延胡索浸膏5 g用2%盐酸200 mL充分溶解，离心(3000 r/min)10 min，取50 mL上清液用5%氢氧化钠溶液分别调至适当的pH值(4、6、8、9、10)，用等倍量的有机溶剂(二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚)萃取3次，合并萃取液，回收溶剂，干燥，备用。精密称取所制备的萃取物10 mg，置于10 mL 容量瓶中，加适量甲醇溶解并稀释至刻度，超声，摇匀，过0.45 μm 微孔滤膜，按照上述色谱条件进行测定，采用外标一点法计算各生物碱含量。

2.4 两种生物碱结晶溶剂考察

取含有海罂粟碱或去氢延胡索甲素的萃取物，分别用多种有机溶剂溶解、重结晶，选择适宜的结晶溶剂。

3 实验结果

3.1 pH梯度对生物碱萃取的影响

延胡索浸膏的酸水溶液，用5%氢氧化钠溶液分别调pH值至4、6、8、9、10，然后用石油醚萃取。结果(图1)表明，随着pH的升高，萃取出的总生物碱分别占浸膏总生物碱的6.9%、54.2%、27.2%、40.6%和64.0%，pH值为6和10时的总碱萃取率最高。生物碱的含量测定结果表明，pH值为10时萃出的总碱部位中海罂粟碱含量最高，占浸膏中海罂粟碱总量的92.51%；pH值为6时，萃出的总碱中延胡索甲素和乙素的总量最高，占浸膏中两者生物碱总量的82.90%；pH值从6→10，萃出的总碱中延胡索甲素和乙素的占比降低，海罂粟碱占比逐渐增高，因此pH 10为萃取海罂粟碱的最佳pH值。由图1可见，萃取总碱中的主要生物碱为延胡索甲素、乙素和海罂粟碱，去氢延胡索甲素含量较低，据此采用分步连续萃取法：在pH 6时把延胡索甲素和延胡索乙素先萃取出来，将溶液调至pH 10萃取海罂粟碱，然后用二氯甲烷萃取去氢延胡索甲素。

DHC-去氢延胡索甲素，Glaucine-海罂粟碱;THP-延胡索乙素;Cor-延胡索甲素

3.2 萃取溶剂和次数对生物碱的影响

为了考察不同溶剂对生物碱萃取的影响，用5%氢氧化钠溶液将浸膏酸水溶液分别调至pH 6或pH 10，分别用二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚萃取2次，测定各生物碱的含量，计算萃取率。结果(图2A、2B)表明，无论在pH 6还是pH 10，二氯甲烷或乙酸乙酯可以将所有的生物碱都萃取出来，没有选择性；石油醚则具有较好的选择性，pH 6时萃取的主要是延胡索甲素和乙素，pH 10时则海罂粟碱萃取率最高。萃取了延胡索甲素、乙素和海罂粟碱后的溶液，利用二氯甲烷无差别萃取的性质将去氢延胡索甲素萃取出来。萃取次数的研究结果(图2C、2D)表明，无论在pH 6还是pH 10，石油醚萃取1～3次，萃出的生物碱依次降低，2次的萃取率已在93%以上，从节约溶剂和时间的角度考虑，选择萃取2次。

A、C：pH = 6；B、D：pH = 10

3.3 溶剂对生物碱重结晶的影响

取主含海罂粟碱和去氢延胡索甲素的萃取物，分别用乙酸乙酯、乙醇、甲醇溶解进行重结晶。结果显示，乙酸乙酯溶液中析出的海罂粟碱结晶纯度为99.1%，甲醇中析出的去氢延胡索甲素结晶纯度为99.5%。因此，选择乙酸乙酯和甲醇分别为海罂粟碱和去氢延胡索甲素的重结晶溶剂。

3.4 两种生物碱制备工艺的确定与验证

制备工艺确定如下：延胡索药材粉末→8倍量80%乙醇回流提取两次，每次1.5 h→浓缩干燥得浸膏→用2%盐酸充分溶解，离心→上清液用5%氢氧化钠调至pH 6→石油醚萃取2次后残液调至pH 10→石油醚萃取2次，萃取液为海罂粟碱粗品→残液用二氯甲烷萃取2次，萃取液为去氢延胡索甲素粗品。

取3份延胡索药材粉末50 g，按照上述工艺平行操作，HPLC检测，计算海罂粟碱和去氢延胡索甲素含量粗品的量，进行工艺验证。将得到的海罂粟碱和去氢延胡索甲素粗品分别用乙酸乙酯和甲醇重结晶。结果表明，从3份样品中得到的海罂粟碱分别为37.85、36.15、36.10 mg，RSD为2.71%，重结晶后纯度分别为98.7%、99.0%、99.1%，RSD为0.21%；去氢延胡索甲素分别为31.10、32.00、33.55 mg，RSD值为3.85%，重结晶后纯度分别为99.3%、99.2%、99.5%，RSD为0.15%；表明该工艺稳定可靠。

4 讨 论

本文通过对影响海罂粟碱和去氢延胡索甲素萃取的关键因素的研究，建立了一种快速简单适合工业化生产海罂粟碱和去氢延胡索甲素单体的方法。本文首次提出不同pH梯度结合不同溶剂的萃取方法，在除去杂质以及非目标化合物的同时，将延胡索提取物中所含的阿朴菲类生物碱海罂粟碱和原小檗碱型生物碱去氢延胡索甲素分别萃取，得到目的生物碱含量达到90%左右的萃取物，经过简单的重结晶之后纯度可以达到98%以上。该制备方法工艺简单、高效，回收率高，生产成本低，为这两个生物碱的工业化生产提供了良好的解决方案。