肝癌衍化生长因子对大肠癌早期血管形成的调节作用研究

乔镇 金牡丹 周嘉鹤 沈忠

大肠癌的发病率在全球常见恶性肿瘤中排第4位[1]。近年来，我国大肠癌病死率呈上升趋势[2]。根据大肠癌发病危险因素采取相应的干预措施，对降低大肠癌发病率和提高早期诊断率有重要意义[3]。肝癌衍化生长因子（hepatoma-derived growth factor，HDGF）是一种最初从条件培养的Huh-7肝癌细胞系中提取出来肝素结合蛋白[4-5]。HDGF可能通过诱导血管内皮生长因子（VEGF）的产生促进血管生成，从而参与肿瘤的发生、发展过程。许多体外肿瘤细胞系、原发细胞（血管平滑肌和血管内皮细胞）[6]及体内多种肿瘤细胞，如胃癌[7]、胆囊癌[8]、胰腺癌[9]、食管癌[10]、肾癌[11]、肺癌[12]细胞等均可表达 HDGF，诱导肿瘤血管形成，促进肿瘤发生、发展。微血管密度（microvessel density,MVD）是反映肿瘤血管形成程度的指标，也是影响结肠癌预后的因素之一[13]。基于此，本研究旨在探讨HDGF在大肠癌发生、发展过程中对血管形成的调节作用及其在大肠癌早期诊断中的意义，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 组织标本 选取2010至2012年在杭州市第三人民医院行手术切除治疗的50例大肠癌组织及对应的癌旁正常肠黏膜组织（距癌周＞10cm）标本。所有病例手术前均未接受放射、化学治疗及免疫抑制剂治疗，其中男32 例，女 18 例；年龄 27～83（56.35±29.2）岁。另择同期在杭州市第三人民医院行结肠镜下摘除术的25例腺瘤性息肉组织标本。所有标本均经病理学检查确诊，液氮冷存后转入-80℃冰箱保存。

1.2 试剂和仪器 鼠抗人VEGF单克隆抗体、鼠抗人CD34单克隆抗体、sunpoly-HII/HRP兔、鼠通用型试剂盒均采购自上海太阳生物技术有限公司，兔抗人HDGF单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。TRIzol试剂、HDGF、GAPDH引物均购自美国Invitrogen公司，荧光定量试剂、多聚胸腺嘧啶引物购自日本Takara公司。PCR引物由上海英骏生物公司合成。GAPDH正义链∶5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反义链∶5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。 HDGF 正 义 链 ∶5′-GAGGGTGACGGTGATAAGAA-3′，反义链∶5′-GAAACATTGGTGGCTACAGG-3′。台式离心机为美国Eppendorf公司产品，实时PCR系统为美国Bio-Rad公司产品，PCR扩增仪为美国Applide Biosystem公司产品，2100生物分析仪为德国Agilent公司产品。其余实验材料及试剂取自杭州市第三人民医院病理中心实验室。

1.3 方法

1.3.1 HDGF、VEGF蛋白表达检测 采用免疫组化法。制备大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织标本的3μm连续切片，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，高温高压抗原修复；SP法染色（按说明书操作），DAB显色，苏木精复染；脱水、透明、封片。采用已知阳性片作阳性对照，PBS分别代替 HDGF、VEGF、CD34单克隆抗体作为阴性对照。HDGF蛋白以细胞质和（或）细胞核着棕黄色为阳性染色，≥90%的细胞质和细胞核均为阳性染色为表达阳性。VEGF蛋白以细胞质和（或）细胞核着棕黄色为阳性染色，每张切片阳性细胞数≥10%为表达阳性。

1.3.2 MVD检测 用抗体CD34标记新生血管，每张切片首先在低倍镜（×100）下挑选MVD最高的区域，然后再高倍镜（×400）下，随机计数5个视野的被CD34染成棕黄色的血管数目，取平均值作为该病例的MVD值。

1.3.3 HDGF mRNA表达检测 采用荧光定量RT-PCR法。受经费限制，采用随机数字表法选取大肠癌及对应正常肠黏膜组织标本、腺瘤组织标本各10例进行荧光定量RT-PCR检测。大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织的总RNA提取：取组织标本约100mg研磨至粉末，加入TRI－zol裂解液1ml混匀，转入1.5ml EP管。每升TRIzol加氯仿0.2 L，紧闭离心管，剧烈摇荡15s，室温放置2min，离心（4°C，30min）；取上层水相转入新的离心管，等比例加入异丙醇，上下颠倒10次后，-20°C沉淀30min以上，离心（4°C，30min）；弃上清液，加入 1ml的 75%乙醇溶液，混匀，再次离心（4°C，10min）；弃上清液，超净台内室温干燥10min。将RNA溶于30μl RNase-free水中，-80°C保存。取1μl，利用Agilent 2100观察RNA质量，并用紫外分光光度计测定抽提RNA浓度、纯度。逆转录合成cDNA和实时qPCR反应：取1μg总RNA按照逆转录第一链合成试剂盒说明书进行cDNA的合成。RT-PCR法按照试剂盒说明书进行操作，检测各模板的Ct值。以正常肠黏膜组织GAPDH为内参，计算大肠癌、腺瘤组织的ΔΔCt值。采用 2-ΔΔCt法计算大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织HDGF mRNA表达水平。

1.4 观察指标 （1）比较大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织HGDF、VEGF蛋白表达情况及MVD；（2）分析大肠癌组织HDGF、VEGF蛋白表达情况与MVD的关系；（3）比较大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织HDGF mRNA表达水平。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件；计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织HGDF蛋白表达情况比较 大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织HGDF蛋白表达阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.05），大肠癌组织HDGF蛋白表达阳性率最高，达80.0%，正常肠黏膜组织仅为8.0%，腺瘤组织介于两者之间，为72.0%，见图 1、表 1。

图1 大肠癌组织HDGF蛋白表达情况（SP法染色；a:×100；b:×400）

2.2 大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织VEGF蛋白表达情况比较 大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织VEGF蛋白表达阳性率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），大肠癌组织VEGF蛋白表达阳性率最高，为86.0%，腺瘤组织为40.0%，正常肠黏膜组织最低，为4.0%，见图2、表2。

表1 大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织HGDF蛋白表达情况比较[例（%）]

图2 大肠癌组织VEGF蛋白表达情况（SP法染色；a:×100；b:×400）

表2 大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织VEGF蛋白表达情况比较[例（%）]

2.3 大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织MVD比较 大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织MVD分别为25.28±4.14、15.24±4.73、12.48±5.81，3 者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。大肠癌、腺瘤组织MVD均高于正常肠黏膜组织（均P＜0.05），大肠癌组织MVD亦高于腺瘤组织（P＜0.05）。

2.4 大肠癌组织HDGF、VEGF蛋白表达情况与MVD的关系分析 HDGF阳性表达的大肠癌组织MVD为26.29±3.43，阴性表达的为 21.60±2.36。VEGF 阳性表达的大肠癌组织MVD为26.22±3.16，阴性表达的为20.00±2.64。HDGF、VEGF蛋白阳性表达者MVD均高于阴性表达者（均P＜0.05）。

2.5 大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织HDGF mRNA表达水平比较 见表3。

表3 大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织HDGFmRNA表达水平比较

由表3可见，大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织HDGF mRNA表达水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），大肠癌组织HDGF mRNA表达水平高于腺瘤、正常肠黏膜组织（均P＜0.05），腺瘤组织HDGF mRNA表达水平高于正常肠黏膜组织（P＜0.05）。

3 讨论

大肠癌一直是发病率位居前列的国民常见恶性肿瘤之一[14]，早期筛查、诊断大肠癌对改善患者预后意义重大。HDGF是一种肝素结合蛋白，最初是从条件培养的肝癌细胞系中提取出来的。研究发现，HDGF与多种消化道肿瘤的发生、进展、预后有关。HDGF在肿瘤的血管形成中起重要作用，作为一种促有丝分裂原，其具有促进内皮细胞增殖、诱导新生血管形成的作用。HDGF参与了血管形成过程，以及多种肿瘤的发生、发展过程，其机制可能是HDGF具有与DNA结合的功能，可参与细胞增殖、分化，从而导致肿瘤浸润、转移。

本研究结果显示，大肠癌组织HDGF表达阳性率和MVD均高于腺瘤、正常肠黏膜组织，在大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织中呈递减趋势，这提示HDGF的高表达可能与大肠癌的癌前病变有关，参与大肠癌的早期病理改变。本研究还发现，HDGF阳性表达的大肠癌组织MVD明显高于阴性表达者，这说明HDGF可促进大肠癌新生血管形成，参与肿瘤的血行转移，为其提供条件。而肿瘤是否发生转移对患者的预后起关键作用，发生转移的肿瘤患者预后不良。

VEGF是目前已知的关键的促进血管形成的因子之一，在肿瘤的血管形成过程中起重要作用，涉及各个系统肿瘤[15]。本研究观察到，大肠癌组织VEGF表达阳性率高于腺瘤、正常肠黏膜组织，在大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织中亦呈递减趋势，这表明VEGF的高表达参与促进肿瘤的早期发生、发展过程。有动物实验研究发现，HDGF可诱导VEGF表达，抗血管内皮生长因子中和抗体可抑制过度表达HDGF的肿瘤的生长[6]。

此外，本实验又从分子生物学角度分析并比较了大肠癌、腺瘤、正常肠黏膜组织HDGF mRNA表达水平。结果发现，大肠癌组织HDGF mRNA表达水平高于腺瘤、正常肠黏膜组织，腺瘤组织HDGF mRNA表达水平高于正常肠黏膜组织。这提示临床可以HDGF mRNA为观察指标，以RT-PCR为辅助检查手段，帮助大肠癌的早期诊断。RT-PCR是一种经济有效的体外扩增技术，取少量的标本即可进行成倍扩增表达，如将此技术应用于临床大肠癌早期诊断，有助于指导临床的早期治疗，改善患者预后。

综上所述，HDGF在大肠癌组织中高表达，通过与VEGF协同作用，促进大肠癌早期血管形成。HDGF表达在大肠癌恶变过程中呈递增趋势，以其为检测指标有助于大肠癌的早期诊断。