中国野生蓝莓总花青素对氯化镉诱导的慢性肝损伤的保护作用

岳 恒,许倩倩,景志行,苏攀峰,许剑锋,*,于晓巍

(1.上海海洋大学食品学院海洋生物制药教研室,上海 201306;2.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海),上海 201306;3.上海交通大学附属上海市第六人民医院东院骨科,上海 201306)

肝脏是腹腔内最大的实质性器官,担负人体的重要生理功能。作为消化器官,肝脏对糖类、蛋白质、脂肪三大营养物质的合成、转化和代谢具有重要作用,保障生命体的生存和发展。目前肝脏疾病成为威胁人类健康的常见疾病之一[1]。随着工业的迅猛发展和经济增长,有毒化学物质,包括重金属和杀虫剂广泛应用于发展中国家,环境中的重金属越来越多,对人类的健康和安全造成了极大的影响[2-3]。重金属镉可经消化道或呼吸道进入人体,对骨骼、肾、肝脏、生殖系统、免疫系统等均可造成损伤,且在人体内的生物半衰期长达10～30年,可引起慢性毒作用[4]。研究[5-7]表明,慢性病(糖尿病、高血压、代谢综合症、癌症等)与体内的氧化应激平衡密切相关,而摄入一些抗氧化成分则有利于改善体内的氧化还原平衡。蓝莓总花青素(blueberry anthocyanins,BA)是蓝莓果实中天然含有的物质,具有抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性[8],但国内外对于蓝莓总花青素的保肝、护肝效果的研究鲜有报道,可能与中国野生蓝莓口感稍差有关[9]。

利用传统解毒剂驱排体内蓄积的镉虽能起到一定的解毒作用,但是对机体本身的副作用较大[10-11]。为了开发天然高效的解毒剂,本研究以CdCl2灌胃小鼠建立慢性肝损伤动物模型,肝脏Cd2+含量、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽-S转移酶(GST)含量、还原型谷胱甘肽(GSH)含量以及血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量为指标,研究中国野生蓝莓总花青素对慢性肝损伤的辅助治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中国野生蓝莓 采摘于中国大兴安岭林区;昆明种小鼠(SPF级,雄性) 50只,体重(18±2)g,许可证号:SCXK(沪)2012-0002,上海斯莱克实验动物有限责任公司;XAD-7HP大孔树脂 美国Sigma公司;总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒、谷胱甘肽-S转移酶(GST)试剂盒、还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;氯化镉(CdCl2) 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;其他试剂均为分析纯。

SB25-12D型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;WFX-10型原子吸收分光光度计 北京第二光学仪器厂;6400型火焰光度计 上海分析仪器厂;UV-2450型紫外可见分光光度计 日本岛津;CR-21G型高速冷冻离心机 日本Hitachi公司;AEROSET全自动生化分析仪 美国雅培制药有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 中国野生蓝莓总花青素的提取 纯化总花青素由本实验室改进Prior RL等[12]的方法自行提取,蓝莓冻果粉碎后冷冻干燥成粉末状,过60目筛,取200 g粉末,与甲醇∶水∶甲酸=85∶15∶0.5(体积比)的3000 mL混合溶液混匀,搅拌30 s,超声功率500 W下,于40 ℃超声5 min,在此过程中充分摇匀2次,使样品重新混匀,静置5 min后,搅拌30 s,静置5 min。离心10 min(6000 r/min,4 ℃),收集上清液。残渣中加入2000 mL甲醇∶水∶甲酸=85∶15∶0.5的混合溶液按上述方法继续提取,重复提取5次左右,直至残渣中颜色不再变化,合并所有上清液,离心10 min(8000 r/min,4 ℃),取上清液,40 ℃减压蒸发除去甲醇,置于-20 ℃冰箱保存。将上述所得的提取液装入XAD-7HP大孔树脂柱中纯化,体积比为1∶3。大孔树脂采用湿法装柱,先用 95% 乙醇洗脱 2～3 个BV,其次用蒸馏水洗至无醇味,最后用2～3倍体积 0.5%甲酸水溶液饱和吸附柱,上样2 mL,充分吸附后开始洗脱,流速0.5 mL/min,先用超纯水洗脱,去除多糖、蛋白等杂质,再用0.5%甲酸酸化的甲醇洗脱5 BV,回收洗脱得到的总花青素,40 ℃减压蒸馏去除酸化甲醇,乙酸乙酯(1∶3=v∶v)室温下萃取3次,每次30 min,最后减压浓缩收集得总花青素,置于-20 ℃保存[13]。

1.2.2 中国野生蓝莓总花青素含量的测定 采用pH示差法测定蓝莓总花青素的含量(矢车菊-3-O-葡萄糖苷为对照),各取1 mL样品分别加入4 mL pH4.5的醋酸钠缓冲液(0.4 mol/L)和0.025 mol/L氯化钾缓冲溶液(pH1.0),充分振荡均匀,分别在波长520和700 nm下测定吸光值。重复3次,结果按照以下公式计算。

式中:C-中国野生蓝莓中总花青素的含量,mg/100 g;A=(OD520-OD700)pH1.0-(OD520-OD700)pH4.5;ε-摩尔吸光系数,按照矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔系数进行计算,是26900;MW-矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔质量,是449.2 g/mol;DF稀释因子;1比色皿宽度(1 cm)。最后结果用100 g样品中含有总花青素的量(mg)来表示。

1.2.3 动物分组与处理 小鼠适应性饲养一周,按体重均衡原则随机分为5组,每组10只,分别为空白对照组(灌胃0.3 mL生理盐水)、镉损伤组(灌胃1.0 mg/kg/d的CdCl2+生理盐水共0.3 mL)、蓝莓总花青素低剂量组(BAL)、中剂量组(BAM)和高剂量组(BAH)(灌胃1.0 mg/kg/d的CdCl2,同时分别灌胃10.0、20.0、40.0 mg/kg/d的蓝莓总花青素共0.3 mL)。每10 d固定时间对小鼠进行称重,并按体重量进行精确喂饲,连续饲养90 d,实验结束前24 h,所有小鼠禁食不禁水。

1.2.4 小鼠生活状态观察 观察各组小鼠的生长情况,包括小鼠体重、身体外观、进食量多少、排泄物量以及反应灵敏性等,并及时做好相关记录。

1.2.5 小鼠肝脏系数的测定 解剖小鼠并取出肝脏,置于预冷过的生理盐水中去除表面结缔组织,经预冷过的生理盐水漂洗3～4次后,用滤纸吸干表面水分并称重,最后根据公式计算肝脏系数:

1.2.6 肝脏组织中Cd2+含量测定

1.2.6.1 标准曲线的绘制 精确称量CdCl2,用3 mol/L的硝酸完全溶解,配制含Cd2+为1 g/L的标准液备用。使用时逐级稀释为50、10、5、1、0.5、0.1、0.01 μg/L的标准稀释液液,4 ℃冷藏保存。开始测量时,按Cd2+浓度从小到大依次进样,对不同浓度Cd2+溶液的吸光值进行检测,最后记录吸光值绘制标准曲线。

1.2.6.2 Cd2+含量的测定 5组小鼠肝组织样本,分别称取相同质量,置于坩埚内并标号,安置于马弗炉中,500 ℃中灰化6 h;待自然冷却后,用8 mL 3 mol/L的硝酸溶解残留物直至完全溶解,过滤不溶物,于恒定4 ℃条件下保存。按照标准液中Cd2+浓度从小到大的顺序进样,得到标准曲线图1。当R2>0.99 时,开始进行样品测量,并记录吸光度值,每个样品测定三次,并对不同组小鼠肝脏Cd2+含量进行计算统计。

1.2.7 血清生化指标的检测 眼眶取血约1 mL,置 EP 管中静置 15 min,然后 4 ℃、3500 r/min 离心10 min,分离血清,-80 ℃保存备用。采用全自动生化分析仪检测谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性。

1.2.8 肝组织匀浆液中氧化损伤指标的测定 将取完血的小鼠断颈处死,解剖分离肝脏,精确称重,液氮冷冻后置 EP 管中,-80 ℃保存备用。称取约0.2 g肝脏,加入9倍体积的生理盐水充分研磨制成匀浆,于4 ℃、3000 r/min离心10 min,取上清液-80 ℃保存备用。按试剂盒所述步骤检测样本中总抗氧化能力(T-AOC)、抗氧化指标GSH、GST及脂质过氧化指标MDA。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 蓝莓总花青素含量测定结果

以波长520 nm为最大吸收波长,并将花青素含量转变成每100 g样品含的花青素的量(mg)。测得该实验蓝莓中总花青素含量为(149.66±3.45) mg/100 g冻果。

2.2 小鼠生活状态观察

观察各实验组小鼠生长情况,发现空白对照组小鼠食欲旺盛,生长迅速,排泄物呈黑褐色规则米粒状,毛皮光亮、柔顺,腿部肌肉有力、富有弹性;眼睛明亮有神,反应敏捷;镉损伤组小鼠嗜睡厌食,生长缓慢,排泄物稀少,呈灰色、灰褐色米粒或不规则形状;毛皮暗哑泛黄;行动缓慢、反应迟钝;蓝莓总花青素3个剂量组,小鼠进食正常,排泄良好,毛皮柔顺,眼睛灵活有神,反应机敏。

研究表明,CdCl2的摄入,对小鼠的食欲、生长、神经发育以及正常的生理活动造成严重影响,而通过饲喂蓝莓花青素,小鼠的生长、生活情况得以明显改善。

2.3 小鼠生长状况

由表1可知,镉损伤组与空白对照组比较,差异极显著(p<0.01),说明镉能够对生长期小鼠的正常生长造成严重影响;与镉损伤组相比,BA低、中、高剂量干预组小鼠每10 d体重增长差异极显著(p<0.01),表明BA能够在一定程度上改善镉对小鼠所造成的生长缓慢,促进小鼠进食、健康生长。

表1 各组小鼠平均体重增长Table 1 Average body weight of mice in each group

2.4 小鼠肝脏系数

由表2可以看出,与镉损伤组比较,空白对照组及BA低、中、高剂量干预组的肝脏重量及肝脏系数差异不显著,3个剂量的BA组未对肝脏产生不良影响。

表2 各组小鼠肝脏湿重及肝脏系数Table 2 The wet weight of mice liver and liver coefficient in each group

2.5 肝脏组织中Cd2+含量

2.5.1 标准曲线图 按照标准液中Cd2+浓度从小到大的顺序进样,得到标准曲线如图1,其线性回归方程为y=0.0003x+0.0012,R2=0.99993。

图1 Cd2+标准溶液变化曲线Fig.1 Standard curve of the Cd2+ solution

2.5.2 Cd2+含量 由图2可知,每天灌胃1.0 mg/kg的CdCl2,90 d后小鼠每单位肝组织中Cd2+含量达到(26.54±5.43)μg/g,与空白对照组差异极显著(p<0.01),表示建模成功;与镉损伤组相比,BA低、中、高剂量干预组小鼠每单位肝组织中Cd2+含量显著降低(p<0.05),表明镉在小鼠肝脏中代谢缓慢,不易排出,产生明显的蓄积现象,而BA能够很好的抑制镉在肝脏处的蓄积,加速镉排出肝细胞,从而减少游离Cd2+对机体的损伤。

图2 不同组小鼠肝脏组织中Cd2+的含量Fig.2 Cd2+content in liver tissue of different groups of mice

2.6 血清生化指标

由图3和图4可知,与空白对照组相比,镉损伤组AST、ALT指标均有极显著差异(p<0.01),表明镉对小鼠的肝脏造成了明显的损伤。BA低、中、高剂量干预组AST、ALT指标与镉损伤组差异极显著(p<0.01),且与浓度呈负相关关系,表明BA能够很好的抑制镉引起的肝损伤致的AST、ALT升高,且存在一定的剂量效应关系。

图3 不同组小鼠AST的活性Fig.3 AST activity of different groups of mice

图4 不同组小鼠ALT的活性Fig.4 ALT activity of different groups of mice

2.7 肝组织匀浆液氧化损伤测定

从表3可知,与空白对照组相比,镉损伤组T-AOC、GSH、GST、MDA指标均有极显著差异(p<0.01);与镉损伤组相比,BA高剂量干预组(40 mg/kg/d)的T-AOC、GSH、GST、MDA含量差异极显著(p<0.01),BA中剂量干预组的T-AOC、GSH、GST含量显著升高(p<0.05),但MDA含量的变化不显著。BA低剂量干预组的T-AOC、GSH含量显著升高(p<0.05),但GST与MDA含量的变化不显著。整体来看,随着BA浓度的升高,T-AOC、GSH、GST含量随着升高,而MDA含量随之降低。表明BA能够在一定程度上抑制镉损伤致小鼠肝脏组织氧化损伤,且抑制能力与BA的浓度相关。

表3 氧化损伤指标Table 3 Oxidative damage indicators

3 讨论与结论

镉致肝损伤的机理至今没有明确的解释,普遍的认为是镉毒性与氧化损伤密切相关。例如急性镉中毒情况下造成的氧化损伤与细胞内谷胱甘肽的减少有关[14],也有研究认为镉染毒破坏了机体内部各个方面的动态平衡,进而造成对身体严重的影响[15-16]。镉对机体的氧化损伤有很多种途径,常规是两种,分别是破坏体内自由基的平衡和抗氧化系统的功能[17]。

当肝实质细胞损伤,细胞膜结构和通透性的改变或破坏,使得肝细胞内的转氨酶ALT、AST,进入血液中,因此血清转氨酶ALT、AST 水平可以作为反映了肝脏组织细胞的损伤程度的敏感指标[18]。前者活性升高则提示肝细胞破坏、细胞膜通透性增强,后者活性增强提示线粒体损伤。两者极易受到Cd2+的影响,其活性的变化可以反映肝细胞损害程度。本研究发现,Cd2+的毒性效应会显著增加小鼠血清 AST、ALT 的释放,对肝脏造成炎症损伤,而适当量的中国野生蓝莓总花青素的干预能使血清 AST、ALT 释放减少,减轻氯化镉诱导的肝损伤的炎症反应。实验结果表明,1.0 mg/kg/d CdCl2饲喂小鼠90 d,小鼠日均体重增长极显著下降(p<0.01),且血清指标AST、ALT极显著升高(p<0.01),提示本实验小鼠慢性肝损伤模型建立成功,与前人报道用CdCl2建立慢性肝损伤模型[19]相比,本实验的染镉周期增加到了90 d,大大增加了慢性肝损伤建模的周期,进一步研究了小鼠体重增长、肝脏组织中Cd2+的含量、血液、肝脏各项指标在这个周期中的变化。且本实验镉损伤组MDA含量极显著高于空白对照组(p<0.01),说明连续90 d灌胃1.0 mg/kg/d的CdCl2可诱导肝脏细胞脂质过氧化损伤明显增强,与以往的报道一致[20]。

在肝损伤的防治方面,与自由基密切相关的物质以及外源性抗氧化剂起着重要的作用[21-22]。机体内过量游离自由基会导致蛋白质、脂肪和核酸的氧化损伤,心脏病、关节炎、老年痴呆、癌症等都与体内氧化与抗氧化体系失衡有一定关系[23]。人体内存在天然的抗氧化系统,而外源的重金属离子会破坏机体的氧化系统的平衡,从而导致机体氧化应激损伤[23]。大量研究表明,镉通过影响肝脏细胞中相关抗氧化酶的活性,从而影响肝脏细胞中自由基的清除,肝脏细胞中游离的自由基作用于多不饱和脂肪酸生成MDA,加重脂质过氧化损伤,从而造成小鼠的肝脏损伤[25-27]。Cd2+体内的长期累积会导致机体氧化、抗氧化系统失衡,导致脂质过氧化终产物MDA增多,MDA是脂质过氧化损伤的主要降解产物,因此测定MDA这个指标能够反映小鼠肝脏细胞脂质过氧化损伤的情况,而 T-AOC、GSH和 GST 作为抗氧化酶系统中的重要组成部分,能有效反映体内抗氧化系统的状态。本文中BA各剂量干预组MDA指标均与镉损伤存在差异,且与浓度呈负相关关系,表明蓝莓花青素对小鼠肝脏氧化损伤有一定的保护作用,本结果与邹志辉等[20]报道的葡萄籽原花青素对镉致肝损伤保护作用的研究结果一致。蓝莓总花青素可能通过大量清除肝脏细胞中自由基,从而改善肝脏细胞过氧化损伤,增强肝脏细胞中相应抗氧化酶的活性,从而提高肝脏细胞抗氧化能力,达到有效的保肝效果,但还需进一步深入研究证实。

本研究填补了中国野生蓝莓总花青素在治疗重金属致慢性肝损伤方面研究的空白,为其开发成新型天然的解毒剂提供了重要依据,但是目前国内对中国野生蓝莓总花青素保肝效果的研究报道较少,因此需要对其作用机制展开进一步的研究。