环磷酸腺苷颗粒剂的制备

张义军,撒玉良,陈 文,*

(1.石河子大学医学院第一附属医院药剂科，新疆石河子 832000;2.石河子大学药学院，新疆石河子 832000)

红枣(Zizyphusjujubadates),是鼠李科枣属植物枣树的果实,原产于我国,栽培历史悠久,在中国,红枣的栽培面积及产量占世界产量的90%以上。但是我国红枣产业存在产品单一,技术含量较低及生产规模不够大等问题。新疆所产的红枣由于其拥有日照时间长,昼夜温差大等特殊的自然条件,所产红枣中的营养成分更是丰富。红枣中的主要营养成分有蛋白质、天冬氨酸、谷氨酸等多种氨基酸，维生素A、维生素B及环磷酸腺苷(cAMP)等[1],糖类主要是多糖以及水溶性糖等。

红枣中各种活性成分最为突出的则是cAMP,它是重要的生命物质,相关研究证实,包括癌症、高血压、心肌梗死及冠心病等多种疾病[2-3]的发生都与cAMP的代谢有关,cAMP是核苷酸的衍生物,由腺嘌呤、核糖和磷酸组成,磷酸与核糖的3′,5′位相连成环状,由此称为环磷酸腺苷,它是蛋白激酶的致活剂,是一种具有生理活性的重要物质,作为生命信息传递的第二信使,能参与细胞分裂与分化、形态形成、类固醇生成、糖原和脂肪分解等多种生理生化过程,在基因表达中发挥至关重要的作用,能抑制细胞增殖、癌细胞、过敏性疾病等,对神经系统也有调节作用,还能诱导激素或酶的合成,促进机体合成代谢[4]。cAMP的合成方法较多,有化学合成法、微生物发酵法以及从天然产物中提取(包括水浴提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法等)[5-7],但是合成法与微生物发酵法成本较高,而且产率较低,故从天然产物中提取是获得cAMP比较重要的途径。有数据表明,红枣中cAMP的含量高达100～600 nmoL/g,其含量是已经测定的180中动植物种最高的一种,是制备cAMP的最佳植物[8]。目前cAMP临床使用的产品主要是其注射剂,但在用药依从性等方面存在着问题,本研究通过对已报道的cAMP提取方法进行选择及优化,将获得的cAMP制备成为用药依从性较好的颗粒剂,不仅解决cAMP用药依从性差的问题,而且有携带方便等诸多优点。

本实验以和田红枣为研究目标,采用响应面实验设计方法进行cAMP提取工艺的优化,通过正交实验设计优化颗粒剂最佳辅料配比,采用HPLC法进行含量分析,为新疆红枣产业多元化,商品多元化及对cAMP的充分利用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新疆和田红枣 2016年10月采摘,去核,在40 ℃下干燥,粉碎后粉末过40目筛,室温保存;cAMP标准品 纯度98%，北京索莱宝科技有限公司;甲醇 色谱醇，国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇 分析纯，天津市富宇精细化工有限公司;乳糖 分析纯，天津市福晨化学试剂厂;可溶性淀粉 分析纯，天津市盛奥化学试剂有限公司;糊精 分析纯，天津市盛奥化学试剂有限公司;蒸馏水 实验室自制。

AL204电子分析天平 奥豪斯国际贸易(上海)有限公司;岛津高效液相色谱仪 岛津企业(管理)有限公司;WD800-微波炉 乐金电子(天津)电气有限公司;KQ-500DE型数控超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司;DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司;TDL-5型低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂;

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 将红枣清洗后去核,粉碎,过40目筛,备用。

1.2.2 提取方法选择 参考文献[9-11],对水浴提取法、微波辅助提取法和超声波辅助提取法三种方法进行比对。

水浴提取法:准确称取50.000 g枣粉,加入100 mL蒸馏水,于室温下浸泡12 h。经过浸泡后将其加热至约60 ℃,然后经打浆机打浆1 h,抽滤,再将其枣渣同上述操作重复一次,合并滤液,得cAMP提取液,在50 ℃条件下减压浓缩,浓缩至50 mL,取浓缩液2 mL置于50 mL的容量瓶,用蒸馏水稀释至刻度,用0.45 μm滤膜过滤,进行HPLC测定。

微波辅助提取法:准确称取枣粉2.000 g,以料液比1∶30溶解于体积分数10%的乙醇溶液常温浸泡6 h,300 W微波功率处理3 min,所得溶液在3000 r/min下离心5 min,上清液即cAMP提取液,经抽滤、在60 ℃下真空浓缩后,用双蒸水在50 mL的容量瓶中定容,过0.45 μm滤膜,进行HPLC测定。

超声辅助提取法:准确称取枣粉4.000 g,放入锥形瓶中,加入体积分数为15%的乙醇,按料液比1∶20,超声功率75 W,超声温度40 ℃,超声时间15 min进行超声波辅助萃取,超声萃取后取出放入40 ℃的水浴中继续提取8 h,以转速3000 r/min离心5 min,取上清液置入100 mL浓缩瓶中,残渣再加体积分数为15% 的乙醇溶液10 mL,同条件再次离心,合并上清液,所得上清液经真空浓缩后转入50 mL的容量瓶中,最后用pH为3(用体积分数为10%的乙酸调节pH达酸性条件)的双蒸水定容至刻度。取上述稀释液25 mL再稀释一倍,所得稀释液过0.45 μm滤膜,进行HPLC测定。

1.2.3 环磷酸腺苷含量测定方法 色谱条件与系统适用性实验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以0.2%的甲酸溶液-甲醇(80∶20)为流动相,检测波长为259 nm。取cAMP对照品约10.0 mg,加双蒸水5 mL使溶解,加稀盐酸溶液与氢氧化钠溶液调pH至中性,用双蒸水稀释成0.1 mg/mL的溶液,取20 μL注入液相色谱仪,调整色谱系统,环磷酸腺苷峰与相邻杂峰的分离度应符合要求。理论塔板数按环磷酸腺苷计算不低于2000,拖尾因子应小于1.4。

取适量环磷酸腺苷提取液,稀释至一定浓度,作为供试液,精密量取20 μL注入液相色谱仪,记录色谱图;另取环磷酸腺苷对照品适量,同法测定,按外标法以峰面积计算,即得cAMP含量。

cAMP标准工作曲线绘制:准确称取一定质量的cAMP标准品,置于10 mL的容量瓶中,用去离子水稀释成浓度为5.8、17.4、29、40.6、52.2 μg/mL的标准溶液,取配制的标准溶液20 μL,注入高效液相色谱仪,记录色谱图中峰面积,以标准品浓度(μg/mL)为横坐标,峰面积(即mAU)为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.4 响应面法优化最佳提取工艺 在前期实验基础上,选用微波辅助提取法作为 cAMP的提取方法,以cAMP的提取率为指标。根据BOX-Behnken中心组合实验设计原理,应用Design-Expert-8.0.6软件,选取料液比(A),提取时间(B),微波功率(C),乙醇体积分数(D),微波处理时间(E)5个因素,每个因素进行三水平实验,分别以-1、0、1进行编码,以cAMP的提取率为响应面响应值,实验因素水平设计见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Variables and levels in response surface design

cAMP提取率(%)=提取液浓度×提取液体积÷枣粉质量

1.2.5 环磷酸腺苷颗粒剂的制备

1.2.5.1 辅料的筛选 称取浸膏5.000 g,分别取可溶性淀粉、乳糖、糊精以及这三种辅料以质量比1∶1混合后的混合辅料各20.000 g,将辅料与浸膏混合,以体积分数为75%的乙醇为润湿剂,用手指不断的搓捏,混合均匀,以“手握成团,轻压即散”作为制软材的标准,在16目筛上制粒,制得的颗粒放入烘箱,55 ℃下,干燥3 h。

1.2.5.2 辅料筛选指标确定 通过测定辅料与浸膏混合均匀后制备的颗粒的成型性、堆密度、休止角、溶化率以及吸湿性等指标,并以成型性分值、堆密度分值、休止角分值、溶化率分值以及吸湿性分值来评选出最优的辅料[12]。

综合指标=成型性分值(15)+堆密度分值(15)+休止角分值(15)+溶化率分值(20)+吸湿性分值(35)。

上述5项检测结果进行综合评分,对比每个辅料所积的分数,分值最高的即为颗粒剂最佳辅料。

成型性测定:对所制备的颗粒精确称重,先过1号筛,再过5号筛进行整粒,通过1号筛而不过5号筛的颗粒进行称重,按公式计算颗粒剂成型率及成型性分值。

成型率(%)=过筛后的颗粒质量/过筛前的颗粒质量×100。

成型性分值=(15/最大成型性值)×成型性值。

堆密度检测:将过筛整粒后的颗粒称重后放入干燥的量筒中,轻轻震摇后读取刻度(V)mL,并记录质量(M)g,堆密度值及堆密度分值计算公式如下:

堆密度值=M/V;

堆密度分值=(15/最大堆密度值)×堆密度值

休止角的检测:采用固定漏斗法,将3只漏斗串联并固定在水平的坐标纸上1～2 cm的高度,将颗粒从最上面的漏斗壁慢慢加入,直到颗粒在坐标纸上形成一个圆锥体,圆锥体的顶端与最下面的漏斗口为止,由坐标纸测出圆锥的直径(2R),并测出圆锥体的高度(H),计算出休止角tga=H/R,重复测定5次,计算出平均值。

休止角分值的运算公式:

休止角分值=(最小休止角值×15)/休止角值

溶化率检测:精密称取干燥颗粒0.5000 g,加入10 mL的干燥恒重的离心管中,加入沸水5 mL,振荡5 min,在3000 r/min下离心15 min,弃上清液,在80 ℃下将残渣烘干至恒重,精密称定,计算溶化率及溶化率分值。

溶化率(%)=溶化的颗粒质量/颗粒总重量×100

溶化率分值=(20/最大溶化率)×溶化率值

吸湿性检测:精密称取按1.3.1中制备的6种颗粒剂放入称量瓶中,平铺厚度约为2 mm,然后放入底部装有NaCl饱和溶液的干燥器中(相对湿度为75%),48 h后取出,精密称定。按照如下方式计算吸湿率:

吸湿率(%)=(吸湿后的质量-吸湿前的质量)/稀释前的质量

吸湿率分值=(最小吸湿率×35)/最大吸湿率

1.2.6 正交法优化成型工艺

选择浸膏与乳糖(辅料)比例、乙醇体积分数、干燥温度作为考察因素,以成型性作为评价指标,用L9(34)正交表安排实验,见表2。

表2 L9(34)正交表Table 2 L9(34) Orthographic table

1.2.7 质量控制

1.2.7.1 性状鉴别 颗粒剂外观从颜色、气味与外观形状惊醒观察,取3批颗粒剂样品,分别编号1、2、3进行鉴别,颗粒剂应干燥、均匀、色泽一致、无潮湿、软化、结块、潮解等现象。

1.2.7.2 溶化性检查 按照《中国药典》2010版中关于溶化性检查方法,精密称取3份颗粒剂10.000 g,加热水200 mL,进行溶化性检查。

1.2.7.3 粒度检查 按照《中国药典》2010版附录中的双分法进行测定。

1.2.7.4 干燥失重 取3批颗粒剂各一定质量,在105 ℃干燥至恒重,含糖颗粒应在80 ℃,减失重量不得超过2.0%。

1.2.7.5 微生物限度 依据2010版《中华人民共和国药典》一部附录XIII C项下方法检查。

1.2.7.6 颗粒剂含量测定 取3份不同批次的颗粒剂样品各1.000 g,于10 mL的容量瓶中溶解并稀释至刻度,精密吸取20 μL,在上述色谱条件下进行含量测定。

1.3 数据处理

数据处理采用Excel 2010处理,结果取3次重复的平均值。使用Design-Expert-8.0.6软件的数据处理系统,完成数学回归模型的建立、显著性分析、响应曲面分析[13]。

2 结果与分析

2.1 含量测定方法

按照1.2.1项下方法以纵坐标为峰面积,横坐标为cAMP的量,绘制标准曲线,得cAMP回归曲线为Y=19864X-27656,r=0.9991,表明cAMP进样在5.8～52.2 μg/mL浓度间线性关系良好。cAMP标准品图谱如图1,样品图谱如图2。

图1 cAMP标准品HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of cAMP standard

图2 样品溶液HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogram of Sample solution

2.2 提取方法选择

以cAMP提取率为实验方法选择依据,方法选择结果见表3。

表3 提取方法的选择Table 3 Selection of extraction methods

由表3可知,这三种提取方法中微波辅助提取法的产率最高,同时考虑到水浴法操作步骤繁琐,因此选择微波辅助提取法为cAMP的提取方法。

2.3 响应面实验设计及结果

以cAMP的提取率为响应值(Y)进行优化,结果见表4。

表4 响应面分析结果Table 4 Response surface analysis results

2.4 响应面结果分析

应用Design-Expert.v.8.0.6版软件对实验所得数据进行响应面分析,对各单因素进行多元线性回归,得到模拟回归方程:cAMP提取率(%)=28.46-0.49A-0.22B+0.15C-0.053D+0.50E-0.83AB-0.58AC-1.40AD-0.23AE-1.16BC-0.42BD+0.48BE-0.61CD-0.23CE+0.88DE-1.42A2-1.87B2-1.48C2-0.53D2-0.42E2,响应面回归显著性方差分析见表5。

表5 cAMP提取率响应面结果的方差分析Table 5 ANOVA analysis of cAMP extraction rate response surface results

从表5可知,该模型具有高度显著性(p<0.05),失拟项不显著,同时模型相关系数R2=0.9123,大于0.9,模型相关度较好。其响应值的变化有91.23%与所选变量有关,由表5可知,各因素对cAMP的提取率影响的主次顺序为:D>A>E>B>C,由于该模型相关性很好,所以可以利用该模型进行分析预测最佳工艺。

2.4.1 工艺优化与预测 根据响应面实验设计结果运用Design-Expert.v 8.0.6软件绘制响应值与其中任意两个因素的三维效应面曲线图,响应曲面的陡峭程度,曲面越陡峭,显著程度越高,陡峭程度越小,则表示交互作用显著程度越低。各因素之间交互影响直观效果如图3(a)～(j)图所示为当料液比(A)、提取时间(B)、微波功率(C)、乙醇体积分数(D)、以及微波处理时间(E)中任意三个因素为零水平时,其余两个因素交互作用对cAMP提取率的影响[14]。

由响应面图(图3)及p值的分析可得,两两因素间对响应值均有一定的交互作用,其中料液比-提取时间、料液比-微波功率、料液比-乙醇体积分数、料液比-微波处理时间、提取时间-乙醇体积分数、提取时时间-微波处理时间、微波功率-乙醇体积分数、微波功率-微波处理时间以及乙醇体积分数-微波处理时间交互作用不显著,提取时间-微波功率的交互作用对cAMP提取率影响较为显著(p<0.05)。

为了进一步确证最优工艺条件,对回归方程取一阶偏导等于零,得到曲面最大点,求导方程最后得出各个因素最优条件为:料液比1∶14.55 (g/mL),提取时间7.5 h,微波功率270 W,乙醇体积分数为30%,微波处理时间10 min,在此条件下,cAMP理论提取率403.6 μg/g。

2.4.2 验证实验 为验证模型的可行性,在模型预测的基础上,在料液比1∶15 (g/mL),提取时间7.5 h,微波功率270 W、乙醇体积分数为30%、微波处理时间10 min的条件下重复6次实验,取平均值,得到cAMP提取率为387.8 μg/g,实际提取率与理论已提取率的吻合度为96.1%,表明采用响应面法得到的最优提取条件各参数可靠。

2.5 颗粒剂优化结果

2.5.1 辅料筛选结果 对所选辅料进行综合评分,由表6可知,乳糖的评分最高(97.19),可溶性淀粉含量最低,因此选用乳糖作为cAMP颗粒剂的最优辅料。

表6 综合评分Table 6 Comprehensive score

2.5.2 正交设计实验结果 每份取浸膏5.000 g,按照表3确定的浸膏与辅料的比例以及稀释剂乙醇体积分数进行混合制软材,通过16目筛制粒,按表3所确定的干燥温度下进行干燥,然后测定能通过1号筛且不能通过5号筛的颗粒重量,以成型性作为考察指标,进行正交实验,并对结果进行分析,见表7、表8。

表 7 L9(34)正交实验设计及测定结果Table 7 L9(34)orthogonal test design and determination results

表8 方差分析表Table 8 Analysis of variance table

由表7分析可知,由极差R可知,对成型率影响因素大小依次为浸膏与辅料配比、干燥温度与乙醇体积分数。表8的方差分析表明,辅料与浸膏比例对成型性有显著影响(p<0.05)。

以cAMP颗粒剂成型率为评价指标,最佳制粒工艺条件为A2B2C2,即浸膏与辅料配比1∶4,乙醇体积分数为75%,干燥温度50 ℃。根据最佳工艺条件A2B2C2制备3批颗粒剂并进行合格率测定,成型率分别为97.2%、96.9%、96.1%,平均成型率为96.73%,符合《中国药典》2015版中对颗粒剂粒度的要求,虽然其成型率小于正交实验中的第6、7组实验结果,但是考虑到颗粒剂粒度均一性,前者较后两者的均匀,第6、7组实验所得颗粒均匀性较差,因此选择A2B2C2为最佳制备条件。符合《中国药典》2015版中对颗粒剂粒度的要求。

2.6 颗粒剂质量检查结果

2.6.1 性状检查 本品为颗粒剂,通过多批样品属性检查,均为棕黄色颗粒,味微甜,颗粒均匀,色泽一致,无吸潮、软化现象

2.6.2 粒度检查 按照《中国药典》2010版附录记载的合格率检查方法,双分法进行测定。能通过1号筛而不能通过5号筛的颗粒为合格颗粒,计算合格颗粒收率为95.8%,符合要求。

2.6.3 溶化性检查 按照1.5.2项下方法测定。颗粒剂在30 s内全部溶解,溶液为棕红色澄清液体,符合《中国药典》2010版的要求。

2.6.4 干燥失重 按1.5.4项下方法测定。称取3批颗粒剂质量为2.0021、2.0092、2.0056 g,其在105 ℃下干燥至恒重,失重百分比为1.3%、1.24%、1.28%,均小于2%,所以符合《中国药典》2010版要求。

2.6.5 微生物检查 依据 《中华人民共和国药典》2010版一部附录XIII C项下方法检验,3批cAMP颗粒剂每1 g含需氧菌为700 cfu/g,符合 《中华人民共和国药典》颗粒剂项下要求。

2.6.6 颗粒剂含量测定 取环磷酸腺苷颗粒剂3批样品(20170715,20170718,20170721),按上述色谱条件进行含量测定,得颗粒剂平均含量为156.2 μg/g。cAMP颗粒剂每袋(10 g)cAMP含量不得少于1.5 mg,因此本品符合质量要求。

3 结论

本实验以新疆红枣为原料,选取料液比、提取时间、乙醇体积分数、微波功率与微波处理时间为自变量,cAMP提取率为响应值,利用响应面分析,建立微波提取新疆红枣中cAMP的工艺模型。由回归分析表明,该模型稳定性好,通过显著性分析得到各因素的主效应关系为:乙醇体积分数>料液比>微波处理时间>微波频率>提取时间。研究结果还表明,新疆红枣落地枣cAMP微波提取最佳工艺参数为:料液比1∶15、提取时间7.5 h,微波功率270 W,乙醇含量30%,微波处理时间10 min。cAMP理论提取率为403.6 μg/g,实际提取率为387.8 μg/g,两者吻合度达到96.1%。

实验采用综合评分的方法对cAMP颗粒剂的几种辅料乳糖、可溶性淀粉、糊精以及其混合辅料进行选择,最终选择乳糖作为cAMP颗粒剂的辅料,通过正交实验设计选择出最优的辅料配比,以浸膏:乳糖比为1∶4、乙醇体积分数为75%、干燥温度为55 ℃为最优的制备方案,所制得颗粒剂在粒度、溶化率、吸湿性等方面均符合药典要求。因此,本实验的提取方法以及颗粒剂的辅料选择是正确的,适用于cAMP颗粒剂的制备。