基于RGOQDs / GCE电化学生物传感器对尿酸与嘌呤的电化学行为研究①

2018-08-03,,,,,,

佳木斯大学学报（自然科学版） 2018年4期

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(佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯154007)

0 引言

脱氧核糖核酸(DNA)在遗传信息的存储和蛋白质的合成中起到非常重要的作用，而鸟嘌呤是DNA中的重要嘌呤碱基，参与能量传递、新陈代谢及细胞信号传递；黄嘌呤是嘌呤核苷酸的代谢产物，在黄嘌呤氧化酶作用下转化为尿酸；尿酸被认为是人体内嘌呤代谢的氧化最终产物，广泛的分布于人体血液、尿液及其它生物体的器官及体液中[1]. 尿酸、鸟嘌呤、黄嘌呤含量的检测与多种疾病的诊断、监测、预防和治疗都有着密切的联系，如免疫系统的缺陷和突变、痛风及高尿酸血症. 因此，检测尿酸、鸟嘌呤、黄嘌呤含量的变化对于人类健康和临床医学有着重要的意义，能为多种嘌呤代谢相关的疾病提供参考诊断数据[2, 3].

已报道的常用的检测方法有分光光度法、荧光法、毛细管电泳法、电化学法等，电化学分析法作为一种常用的检测方法在电极的修饰上尤为重要. 氧化石墨烯量子点是一种新型零维纳米材料，其粒径小于100 nm[4]，本实验制备的RGOQDs / GCE对尿酸和嘌呤有着较强的电化学响应，并对检测条件进行了优化，可用于细胞中嘌呤代谢产物的定量检测，该方法操作简单、高效、灵敏度高，具有明显的应用前景.

1 实验

1.1 仪器与试剂

采取差分脉冲伏安法在CHI 660电化学分析仪上室温25 ℃进行电化学检测；三电极检测体系，工作电极为玻碳电极，银/氯化银参比电极和铂丝对电极；全套的细胞培养设备.

氧化石墨烯量子点(GOQDs，先丰纳米材料科技有限公司)，尿酸(UA，Sigma)、黄嘌呤(X，Sigma)，鸟嘌呤(G，Sigma)；磷酸盐缓冲溶液是由0.2 M 磷酸二氢钠(NaH2PO4，上海化学试剂有限公司)和0.2 M磷酸氢二钠(Na2HPO4，上海化学试剂有限公司)制备而成；所用水溶液均为双蒸水配制并于4 ℃冰箱保存.

1.2 RGOQDs / GCE的制备

采用肼还原的方法制备RGOQDs[5]，玻碳电极的表面用氧化铝粉抛光直到得到镜面的表面，在双蒸水和乙醇溶液中各超声5min，然后浸入到RGOQDs溶液中通过电沉积的方程修饰于电极表面，RGOQDs / GCE备用.

1.3 细胞培养与收集

V79细胞购于中国上海细胞库，在含有胎牛血清、盘尼西林、链霉素的DMEM培养基中于37 ℃培养箱中培养，采用原位细胞收集法收集细胞[6].

2 结果与讨论

2.1 RGOQDs / GCE用于尿酸、嘌呤检测的电化学行为研究

为了研究尿酸、黄嘌呤、鸟嘌呤在RGOQDs / GCE的电化学行为，分别对9 μM尿酸、5 μM黄嘌呤、6μM鸟嘌呤、及三种混合标准品于磷酸盐缓冲溶液中进行电化学检测，采用差分脉冲伏安法其检测结果如图1所示. 尿酸在0.3 V(a曲线)左右出现了明显的信号，黄嘌呤(b曲线)和鸟嘌呤(c曲线)在0.7 V左右出现了明显的信号，而当三种标准品混合后，黄、鸟嘌呤的电化学信号无法分开，只呈现了一个电化学峰(d曲线)，这种现象在文献中已有报道. 由此可见RGOQDs / GCE可被用于灵敏的检测尿酸和黄、鸟嘌呤，若检测物中同时含有黄嘌呤和鸟嘌呤会得到一个混合的峰.

图1 (a)尿酸；(b)黄嘌呤；(c)鸟嘌呤；(d)三种混合标准品的曲线图

2.2 RGOQDs / GCE用于尿酸、嘌呤检测最佳富集电位的选取

为了研究RGOQDs / GCE电极对尿酸、嘌呤的最佳检测条件，首先研究了富集电位的影响，图2为不同富集电位下的尿酸(图2 A)、鸟嘌呤(图2 B)、黄嘌呤(图2 C)在RGOQDs / GCE的电化学信号点线图. 由图可见，尿酸(图2 A)在 - 0.3 V的电化学信号最强且曲线平滑，富集电位的改变对鸟嘌呤(图2 B)、黄嘌呤(图2 C)的影响并不大，但黄、鸟嘌呤均在0 V信号最强且曲线平滑，富集电位越小其曲线上漂，由于要同时对尿酸和嘌呤进行检测，综上选取0 V为最佳富集电位.

图2 不同富集电位尿酸(A)；鸟嘌呤(B)；黄嘌呤(C)

电化学信号点线图；嵌图： DPV曲线原图

a - g为 - 0.3，- 0.2，- 0.1，0，0.1，0.2，0.3 V

2.3 RGOQDs / GCE用于尿酸、嘌呤检测最佳富集时间的选取

除去富集电位，富集时间也是电化学检测中常考虑的一个检测条件，图3为不同富集时间尿酸、黄嘌呤、鸟嘌呤标准品的电化学信号点线图，富集时间为0，30，120，240，300，420，480 s. 由图可以看出，经富集后的标准品信号强度明显大于无富集时的电流强度，且随着时间的增加，电化学信号逐渐增强，在360 s时电化学信号最明显，电极也比较稳定，且考虑到实验时间，选取360 s为最佳富集时间.

图3 不同富集时间尿酸(a)；黄嘌呤(b)鸟嘌呤(c)电化学点线图

图4 pH对尿酸(a)；黄嘌呤(b)；鸟嘌呤(c)氧化峰电位(A)和峰电流(B)影响点线图

2.4 RGOQDs / GCE用于尿酸、嘌呤检测最佳pH的选取

图4为pH(3 - 9)对尿酸(a)、黄嘌呤(b)、鸟嘌呤(c)氧化峰电位(图4 A)和峰电流(图4 B)的影响点线图. 由图4 A可见，三种标准品的氧化峰电位随着酸度的增加而增加，线性方程分别为：EUA= 0.679 - 0.0529 pH(R= 0.995)；EX= 1.06507 - 0.05441 pH(R= 0.997)；EG= 1.048 - 0.052pH (R= 0.996)，根据电化学理论，三种标准品在电极表面发生的是两电子伴随两质子的氧化反应. 图4 B可见，三种标准品的峰电流随着酸度的增加而增加，说明在酸性条件下，RGOQDs / GCE电极对三种标准品有着较强的电化学响应.