不同低氧对大鼠肺、主动脉平滑肌细胞增殖的影响

摘要：目的 研究不同低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs ）、主动脉平滑肌细胞（AASMCs ）增殖的影响。方法 将原代培养的大鼠肺、主动脉平滑肌细胞分为对照组常氧（21% O2，74% N2，5% CO2 ）、实验组低氧（15%O2 ，85% N2，5% CO2） ；（10% O2，85% N2，5% CO2） ；（5% O2，90% N2，5% CO2） ；（3% O2，92% N2，5% CO2），培养48h后通过细胞胞计数和WST-1法测定肺、主动脉平滑肌细胞的增殖并分析差异性。结果 表明PASMCs 在各个低氧浓度下均能发生增殖反应，而在10% O2、5% O2、3% O2條件下与对照相比具有呈著性差异（P<0.01）；（AASMCs ）在3% O2条件下可发生增殖反应且与对照相比呈著性差异（P<0.01）。结论 大鼠PASMCs和AASMCs对不同低氧浓度的敏感度不同。

关键词：主动脉平滑肌细胞 肺动脉平滑肌细胞 低氧 增殖

低氧性肺动脉高压（HPH）是高原低氧及慢性阻塞性肺疾患发展成为肺源性心脏病的关键环节。HPH在高原地区较常见，但是很少发生低氧性主动脉，造成这样现象的机制目前还不清楚。HPH的主要病理变化以肺动脉收缩反应增强及肺血管结构重建为主要特征。血管的重构主要是动脉平滑肌细胞（ASMCs）的增殖，ASMCs增殖主要受血管外周微环境的影响，即肺泡氧分压。高压人体呈健康状态时，肺血管所处的周围肺组织中氧分压是105 mmHg，而体循环血管所处的周围组织器官氧分压一般低于40 mmHg。因此，本实验旨在从细胞水平探讨不同低氧对大鼠PASMCs、AASMCs增殖的影响。

一、材料与方法

（一） 材料

雄性 200 g SD 大鼠，由空军军医大学动物室提供；胎牛血清（Hyclone），非必需氨基酸（Hyclone），DMEM高糖培养液（Hyclone），胰酶（Hyclone），wst-1 （碧云天）、其余试剂为国产分析纯试剂。

主要仪器为三气细胞培养箱 （Heraeus）；酶标仪（VERSAmax）；倒置相差显微镜（Nikon）。

（二） 方法

1.原代细胞培养

麻醉约200 g雄性SD大鼠，分离股动脉和肺内第二、三级肺动脉，将分离的中层动脉条浸于10% DMEM中5min后，离心管中切碎，将沉淀后的组织块均匀地种于培养瓶，加含有20%胎牛血清的DMEM培养基，置于95%空气和5%CO2的培养箱中培养3-4h，再轻轻地翻转培养瓶，绝对静止培养3天。实验采用3-5代的PASMCs和AASMCs。

2.细胞增殖实验

分别用胰酶消化PASMCs和AASMCs，用血细胞计数板计数并种于96孔板，密度为5×103细胞，常氧环境下（21%O2），贴壁培养24h。用含5%血清的DMEM饥饿处理24h后，分别放置于15%O2、10%O2、5%O2和3%O2的低氧环境以及21%O2的常氧环境，培养48h后，采用Wst-1在450 nm下测细胞的吸光度OD值，Wst-1的使用方法见使用说明书（碧云天）。

3. 统计学分析

采用IBM SPSS Statistics 20软件进行分析。

二、结果

（一） 增殖结果

各低氧组PASMCs，培养第1天时，增殖缓慢，到第2天时迅速开始增殖，比常氧组明显增多，48h测OD值发现，在10% O2、5% O2、3% O2处理条件下PASMCs与对照相比具有呈著性差异（P <0.01），而在15%O2处理条件下，无显著性差异；低氧组AASMCs在15% O2、10% O2和5% O2处理条件下生长速度与常氧对照组一致，而在3% O2条件下可发生增殖反应且与对照相比呈著性差异（P<0.01），其余低氧条件下均无显著性差异。结果表明细胞水平PASMCs比AASMCs对低氧更敏感。PASMCs与AASMCs的生长曲线如图1。

三、结语

PASMCs和AASMCs经过15% O2、10% O2、5% O2和3% O2一系列低氧处理后，在15% O2浓度时，PASMCs已发生增殖反应，但AASMCs不发生增殖反应，当氧浓度下降到3%时，AASMCs发生增殖反应，二者均发生增殖反应，表明细胞水平PASMCs比AASMCs对低氧更敏感。我们认为，可能由于血管所处周围氧环境差异所致，肺血管长期处于富氧环境中，而体循环血管长期处于低氧环境中，Han JA 报也道在低氧3% O2通过抑制平滑肌细胞eNOS活性，加强大鼠股深动脉的收缩，提示肺动脉与股动脉对低氧反应的本质是一致的，只是发生低氧性血管收缩时的氧分压不同而已，支持了主、肺动脉平滑肌细胞对低氧的敏感度不同这一观点。

参考文献：

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[2]陶慧林，王怀良，郭伟，高山红.几种药物对肺主动脉平滑肌细胞增殖作用影响的比较研究[J].中国现代应用药学，2005，（03）.

[3]魏冰，杜军保，李简，等.高肺血流量对大鼠肺动脉压及肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响[J].北京大学学报（医学版），2002，（01）.

（作者简介：魏琪，硕士，西安培华学院 助教，研究方向：蛋白材料的制备及活性研究。）