在昆虫细胞中表达西尼罗河病毒prM+E蛋白

刘成倩,李 红,陈 斌,易建中

（上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106）

西尼河病毒（West Nile virus,WNV）为单链正股RNA病毒,属于日本脑炎血清群,可引起人、马及鸟类等多种动物发病,表现为高烧、恶心、四肢酸痛等类似感冒的症状,有的表现为脑炎和脑膜炎等严重症状,在非洲、欧洲、亚洲、大洋洲和美洲的多个国家和地区都有病例发生[1]。目前,我国还没有关于发现西尼罗河病毒的报道,但我国是日本乙型脑炎的疫区,所以加强防控很有必要,特别是建立一种特异性好的检测方法更是意义重大。在诸多血清学检测方法中,MAC-ELISA往往能给出最早的结论[2]。有研究显示,同时表达WNV的前膜蛋白（Rremembrine protein,prM）和E蛋白可以形成病毒样颗粒（VLR）,可为MACELISA方法的应用提供抗原[3]。

以往研究大多是利用真核表达载体获得西尼罗河病毒样颗粒,但普遍存在表达不稳定的现象。目前,利用杆状病毒表达系统生产西尼罗河病毒样颗粒的研究还没有报道。作为虫媒病毒,西尼罗河病毒对昆虫细胞有着天然的嗜性,昆虫细胞中具备形成WNV VLR的一些条件,而prM和E蛋白的表达是获得WNV VLR的先决条件。本试验利用杆状病毒表达系统构建包含西尼罗河病毒prM+E基因的重组杆状病毒,之后感染昆虫细胞sf9,以期能利用表达得到的单个蛋白或者VLR作为建立MAC-ELISA方法的抗原。

1 材料与方法

1.1 基因、菌种及试剂

质粒pFast-Bac1、感受态细胞DH10-Bac和昆虫细胞sf9均由上海市农业科学院畜牧兽医研究所病毒课题组提供。prM∕E基因参照西尼罗河NY 99基因序列分段合成。

Taq酶及内切酶EcoRⅠ、PstⅠ和T4 DNA连接酶均购自上海皓嘉科技发展有限公司;Western-Blot显色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;KOD-Rlus购自东洋纺公司。

WNV灭活疫苗兔多克隆抗体为南京市检验检疫局动检部门馈赠。

1.2 引物的设计与合成

为了后续试验的需求,在设计扩增prM∕E基因的上游引物时引入EcoRⅠ酶切位点及偏好昆虫细胞密码子的3个氨基酸和His标签,下游引物引入PstⅠ酶切位点及His标签序列。引物序列WNV-RE-F:GTGGAATTCATGTCGTACTAC CATCACCATCACCATCACGGAGGAAAGACCGGAATTGC,斜体是酶切位点EcoRⅠ,下划线部分为偏好昆虫细胞密码子的3个氨基酸,加粗为His标签序列;WNV-RE-R:GCAACTGCAGTTAATGATGGTGGTGATGATGAGCGTGCACGTTCACGGAGAGG,斜体是酶切位点PstI,加粗是His标签序列。

设计1对位于杆状病毒上的引物M13-F∕R用于筛选重组杆状病毒Bacmid,及后期检测引物WNV-F∕R。引物序列M13-F:GTTTTCCCAGTCACGAC;M13-R:CAGGAAACAGCTATGAC;WNV-F:GCACGAATTCGGAGGAAAGACCGGAATT;WNV-R:AGATCTCGAGAGCGTGCACGTTCACGGA。

上述引物均由上海捷瑞生物科技有限公司合成。

1.3 目的基因的扩增

RCR 反应体系 50 μL:10 倍稀释的质粒模板 1 μL,10 × Buffer（Mg2+free）5 μL,MgSO44 μL,dNTR（2 mmol∕L）5 μL,WNV-RE-F∕R（10 μmol∕L） 各 1.5 μL,KOD-Rlus 酶 2 μL,ddH2O 31 μL;在冰上混合。RCR反应条件:94℃ 5 min;94℃ 45 s,58℃ 30 s,68℃ 2 min,循环35次;最后68℃ 延伸10 min。

1.4 WNV prM+E基因重组pFast-Bac1的构建

利用限制性内切酶EcoRⅠ和PstⅠ分别对prM+E基因RCR产物和pFast-Bac1供体质粒进行酶切,将纯化回收后的RCR产物与pFast-Bac1供体质粒连接,连接物转化大肠杆菌TOR10。将菌落RCR和酶切鉴定为阳性的质粒送往上海华大基因科技股份有限公司测序,测序正确的质粒命名为Rfast-Bac1-W-RE。

1.5 重组杆状病毒Bacmid的构建

将pFast-Bac1-W-RE转化感受态细胞DH10-Bac。取50 μL 1∶100稀释的菌液涂布于含有庆大霉素、四环素、卡那霉素、IRTG、X-gal的LB平板上,置于37℃培养箱培养48 h以上,有蓝白斑出现的时候,在超净台内挑取白色单菌落在新的含有以上5种试剂的LB平板上划线,继续培养48 h,直到划线的菌落全部都为白色,用引物M13-F∕R进行重组菌的鉴定,将鉴定正确的菌落进行质粒抽提。

1.6 重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞sf9

取出一瓶生长状态良好的sf9细胞,将约9×105个细胞接种于6孔板中,加入2 mL SF900-Ⅱ无血清培养基,置于27℃培养箱中使细胞贴壁1 h。将质粒pFast-Bac1-W-RE及转染试剂LipofectamineTM2000按比例稀释,之后按转染试剂说明书进行转染。每个质粒样品设3个复孔。24 h后观察细胞形态,培养96 h后收集细胞上清液,低速离心后分装上清液备用。此为1代病毒液。

1.7 病毒液的扩增

接种细胞的方法同1.6,置于27℃培养箱中过夜,待每个孔内贴壁细胞细胞长至90%—95%,弃掉旧培养基,每孔加入100 μL一代病毒液,补足新鲜的培养基至2 mL。继续培养,每天观察一次。当细胞出现病变时收集病毒液,细胞病变一般表现为:细胞膨大,有的出现裂解。

1.8 感染进程及目的基因表达的转录水平检测

将sf9细胞接种到24孔板中,27℃培养过夜。每个样品重复一孔,每孔加入50 μL病毒液,并留一对孔作为阴性对照。27℃培养2 h后,用RBS 300 μL∕孔洗涤4次;最后加入400 μL培养基,置于27℃培养箱中继续培养。

用ER管每天收集一对孔的上清液和细胞裂解液,连续收集7 d,对照孔于第4天收集,-70℃保存备用。待所有孔收集之后,用少量病毒RNA∕DNA提取试剂盒提取上清中杆状病毒的DNA,用于RCR检测,所用引物为 WNV-F∕R。

按照Trizol试剂说明书提取细胞中的总RNA,用于RT-RCR扩增。反转录体系:3 μL病毒 RNA,1 μL dNTR Mixture（10 mmol∕L）,WNV-R 1 μL（10 μmol∕L）,在冰上混合后 65 ℃ 5 min,冰上急冷 2 min。继续加入 2 μL 5 × RrimeScript Reverse transcriptase Buffer,0.5 μL RNase 抑制剂,0.5 μL RrimeScript Reverse Tanscriptase（5 U∕μL）,2 μL DERC处理水。在冰上混合后,42℃ 1 h后再75℃处理5 min。

RCR 反应体系:反转录模板3 μL,10 ×RCR buffer 5 μL,dNTR（10 mmol∕L）1 μL,WNV-F∕R（10 μmol∕L）各1 μL,Taq酶0.5 μL,最后加入 ddH2O至总体积50 μL;RCR反应条件:95℃ 5 min;94℃ 45 s,60℃30 s,72℃ 2 min,35个循环;72℃再延伸10 min。取RCR产物6 μL在1.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳。

1.9 目的基因表达的蛋白水平检测

将每孔约1×106个sf9细胞接种在6孔板中,27℃培养至贴壁,感染病毒液,并设1个对照孔。27℃培养,每隔2 d收集1孔的上清液和细胞裂解液,对照孔于感染后第4天收集。

细胞裂解液用超滤浓缩管浓缩,所用的截留分子量为10 ku,之后分装10 μL∕管,-70℃保存备用。

1.10 Western-Blot检测

将1.9中细胞裂解液进行SDS-RAGE电泳,按半干转移法转RVDF膜。以WNV兔多抗为一抗孵育1.5 h,二抗用HRR标记的山羊抗兔IgG孵育1 h,用RBST洗后在暗室内曝光显影。

2 结果与分析

2.1 目的条带扩增

prM+E基因片段和引物中含有的His标签序列及酶切位点共2121 bp,与RCR产物结果相符（图1）,表明已获得目的基因片段。

2.2 重组质粒Pfast-Bac1-W-PE的筛选

用内切酶EcoRⅠ和PstⅠ双酶切prM+E基因RCR产物和Rfast-Bac1质粒,连接转化涂板后挑取4个菌落进行RCR鉴定,扩增片段大小与预期结果一致（图2）,说明已筛选出Rfast-Bac1-W-RE阳性重组菌落。

图1 WNV prM+E基因片段的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of WNV prM+E gene

图2 Pfast-Bac1-W-PE菌落PCR筛选Fig.2 Screening of Pfast-Bac1-W-PE recombinants by PCR

初步鉴定为阳性的菌落提取质粒,用EcoRⅠ和 PstⅠ双酶切后,出现一条2121 bp的片段（图3）,与prM+E基因片段大小相符,说明重组质粒 Rfast-Bac1-W-RE构建成功。

2.3 重组杆状病毒的筛选

质粒Rfast-Bac1-W-RE转化感受态细胞DH10-Bac,之后涂布于含有三抗和IRTG、X-gal的LB平板进行筛选,挑取单菌落培养并进行RCR扩增。根据重组杆状病毒质粒的结构示意图（图4）,用3对引物进行验证。使用引物M13-F∕R扩增空杆菌质粒,所得片段长约300 bp,如果发生重组扩增片段长约4400 bp。用引物M13-F和WNVRE-R可以扩增出约3600 bp的片段,最后再用引物WNV-RE-F∕R验证。电泳结果与预期大小一致,说明重组已经发生（图5）。

图4 重组杆状病毒质粒结构示意图Fig.4 Structure diagram of the recombined bacilli plasmid

图3 Pfast-Bac1-W-PE重组质粒酶切鉴定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid Pfast-Bac1-W-PE by restriction enzyme digestion

图5 重组杆状病毒质粒的PCR鉴定结果Fig.5 PCR identification results of the recombinant bacilli plasmid

2.4 重组杆状病毒转染sf9细胞后的病变

细胞病变在感染第二代细胞中比较明显,细胞感染2 d后停止生长,体积逐渐膨胀变大,7 d后出现脱壁和裂解。图6a为正常的sf9细胞,细胞边缘清晰透亮。图6b为感染后细胞膨胀变大的照片,细胞边缘模糊。图6C为细胞裂解后的照片,很多细胞已经发生裂解,内容物外泄。

图6 重组杆状病毒感染sf9细胞Fig.6 The sf9 cells infected by recombined baculovirus

2.5 感染进程的检测

接毒后每隔一天收集细胞上清液和细胞裂解液,连续收毒7次,之后提取培养基中的病毒DNA和细胞中的总RNA。病毒DNA检测结果见图7,可见泳道1—7在2000 bp处均有一条弱带,阴性对照无。

利用RT-RCR检测细胞裂解液中prM+E基因mRNA的转录情况（图8）。泳道1—7均出现特异性条带,在感染后24 h基因就已经被转录,感染后第5—6天最强。

2.6 目的基因表达的蛋白及Western-Blot检测结果

在6孔板中感染的Sf9细胞,每隔48 h收集一个孔细胞,细胞裂解液SDS-RAGE电泳检测结果见图9。在43.0 ku与66.2 ku条带之间,泳道1—4较泳道5多出一个条带,从分子量上来判断应该是51 ku的E蛋白,说明E蛋白已经得到表达。

图7 重组杆状病毒感染sf9细胞1—7 d病毒液检测结果Fig.7 The virus solution detection results of Sf9 cells infected by recombinant baculovirus during 1—7 day

图8 重组杆状病毒感染sf9细胞1—7 d细胞裂解液检测结果Fig.8 The cell lysate detection results of Sf9 cells infected by recombinant baculovirus during 1—7 day

Western-Blot检测结果显示（图10）,表达的E蛋白可以与WNV兔多抗发生特异性反应,而对照孔则无。

图9 感染细胞裂解液的SDS-PAGE检测Fig.9 SDS-PAGE detection of the infected cell lysate

图10 感染细胞裂解液的Western-Blot检测Fig.10 Western-Blot detection of the infected cell lysate

3 讨论

杆状病毒表达系统具有相对稳定、筛选周期短、表达的蛋白折叠正确、表达量高、蛋白较容易分泌、纯化方便等优点,所以本研究选用昆虫细胞表达系统来表达西尼罗河病毒的相关蛋白以用于后续研究。

E蛋白是西尼罗河病毒的主要结构蛋白,国内外有学者已对其功能进行研究。结构域I主要构成E蛋白的基本骨架,结构域Ⅱ参与Ⅱ型细胞识别融合过程[4-6],结构域Ⅲ含有一个类免疫球蛋白的恒定区和受体结合区。史利军等[7]表达了E蛋白的结构域Ⅲ,Western-Blot检测结果表明结构域Ⅲ具有很强的稳定性。Oliphant等[8]为了研究E蛋白上的中和表位,选择表达结构域I和II。prM蛋白是成熟病毒颗粒中的M蛋白的前体形式。prM蛋白有助于E蛋白在内质网膜上的定位及空间构象的形成,并能防止E蛋白在高尔基体囊泡中过早成熟[9]。

本试验构建的prM+E重组杆状病毒在感染后第2天蛋白就得到了较高的表达。用杆状病毒表达系统来表达出完整的prM+E蛋白在国内外属于首例。prM被切割成成熟的M蛋白之后分子量约为7 ku,由于分子量较小,可能被试验中所用的平均截留分子量为10 ku的超滤浓缩管过滤掉,所以在Western-Blot结果中没有检测到prM蛋白的条带,而只有E蛋白条带;按理论prM基因读框位于E蛋白前端,E蛋白得到了表达,prM蛋白肯定也得到了表达。接下来的研究需要验证培养基上清中是否存在病毒样颗粒,如果存在即可作为抗原用于MAC-ELISA等检测方法的建立,为国内构建WNV血清学早期诊断方法奠定基础。