转基因抗虫水稻秀水134-Bt毒蛋白的时空表达分析

白建江,张建明∗,朴钟泽,方 军,杨瑞芳,2∗∗,李钢燮

（1上海市农业科学院作物育种栽培研究所,上海201403,2上海农科种子种苗有限公司,上海201106;3韩国农村振兴厅农业技术学院,水原市441-857）

粮食安全和生态安全是我国农业持续发展中的首要问题。水稻虫害控制主要是通过喷洒化学农药,农药的使用,不仅增加成本,造成环境污染,而且收效也越来越小[1]。培育转基因抗虫水稻新品种是解决水稻虫害的有效途径[2-3]。我国转基因生物新品种培育科技重大专项于2008年经国务院常务会议审议并通过,实施转基因生物新品种培育科技重大专项,对于增强农业科技自主创新能力,提升我国生物育种水平,促进农业增效和农民增收,提高我国农业国际竞争力,都具有重要的战略意义[4]。林冬枝等[5]通过杂交方法把通过安全评估的‘华恢1号’中的Bt基因Cry1Ab∕Cry1Ac转育到‘秀水134’中,获得‘Bt秀水134’。秀水134-Bt是上海市农业科学院作物育种栽培研究所以粳稻‘秀水134’为受体材料,通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法导入抗虫基因cry1Ac1获得的稳定转基因纯系[6]。本实验室获得的秀水134-Bt田间对螟虫具有高度抗性,且主要农艺性状没有因为抗性基因的导入而发生明显改变[6],为水稻转基因抗虫育种提供了一个新材料。目前,转基因生物技术检测方法主要包括RCR、Southern Blotting、生物测定法、酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、Western Blotting、胶体金免疫法等[7]。其中ELISA是最常用的一种固相酶免疫测定方法,其基本原理就是抗原抗体的特异性结合和酶对底物的高效催化。该方法特异性强、灵敏度高、结果易于观察,自出现以来就在临床检测中得到广泛应用,可用来对蛋白进行定量检测,现在已经用于生命科学的许多领域[8-10]。

本研究利用ELISA方法对转基因抗虫水稻秀水134-Bt不同发育时期及不同组织中Bt毒蛋白含量进行检测,研究转基因抗虫水稻秀水134-Bt的毒蛋白时空表达变化规律,以期为转Bt抗虫基因秀水134-Bt的安全监管提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

粳稻品种‘秀水134’（用作非转抗虫基因水稻对照）,以及用它作为受体材料育成的抗虫转基因纯合品系秀水134-Bt[6]。

1.2 取样

分别于水稻的苗期、分蘖期、拔节期、孕穗期、抽穗期和成熟期取样。其中苗期取样部位为根、茎、叶;分蘖期和拔节期取样部位为根、茎、叶和叶鞘;孕穗期和抽穗期的取样部位为根、茎、叶、叶鞘和小穗;成熟期的取样部位为根、茎、叶、叶鞘和成熟种子。各时期每种材料分别取3个单株,取样量0.5 g,液氮速冻,-80℃超低温冰箱保存备用。

1.3 Bt毒蛋白的提取

取20 mg 样品于离心管中,加入 500 μL 蛋白抽提液（包含 100 mmol∕L Tricine、8 mmol∕L MgCl2、2 mmol∕L EDTA、50 mmol∕L β-Mer-thnol、12.5%Glycerol和 1%RVR-40,pH 7.5）,充分混匀、离心,取上清液。

1.4 ELISA测定Bt毒蛋白浓度

按ELISA试剂盒说明进行试验操作（Cry1Ab∕Cry1Ac蛋白检测试剂盒,产品型号:AR003CRBS）。每个样本3个重复,加样和测定严格按照说明书步骤在规定时间内完成,Bio-radimark酶标仪在450 nm波长下进行读数。

1.5 标准曲线制作

Bt毒蛋白Cry1Ab∕Cry1Ac标准样品质量浓度为1 mg∕L（EnviroLogix,Rart 0433）,标准样品梯度稀释,分别配制成 1 mg∕L、0.5 mg∕L、0.25 mg∕L、0.125 mg∕L、0 mg∕L 的标准蛋白溶液。 以 OD 值为横坐标,质量浓度为纵坐标,绘制标准曲线。

1.6 样本ELISA测定数据处理

根据标准曲线计算出回归方程,将样本OD值代入回归方程,计算出相应的Bt毒蛋白含量,最后将结果换算成每克鲜重含有的Bt毒蛋白纳克量,用ng∕g·FW表示。

2 结果与分析

2.1 秀水134-Bt抗虫性表现

稻纵卷叶螟是危害水稻生长的一种重要害虫,危害性大、爆发性广。初孵化幼虫在水稻叶片取食叶肉,随后在叶尖处吐丝卷叶,逐渐形成白色条斑。随着虫龄增加,叶片危害会越来越严重,受害严重的稻田一片枯白,水稻严重减产。人工接虫试验表明,与对照‘秀水134’相比,秀水134-Bt对稻纵卷叶螟表现出高度抗性,转基因植株的每个单株及每个单株叶片都没有表现出虫害,而对照植株几乎全部出现虫害（图1）。

2.2 Bt毒蛋白的时空表达分析

为了解Bt基因在转基因抗虫水稻秀水134-Bt中的表达情况,分别测定了不同生长发育时期（苗期、分蘖期、拔节期、孕穗期、抽穗期和成熟期）和不同组织器官中Bt毒蛋白的表达情况（表1）。可以看出,各个时期不同器官中Bt毒蛋白均有表达,但表达量差异显著。同一时期不同组织中Bt毒蛋白表达量存在显著性差异,苗期叶片中Bt毒蛋白含量达到 4300.97 ng∕g·FW,为根系（10.49 ng∕g·FW）的 400倍以上,为茎（83.34 ng∕g·FW）的50倍左右。 分蘖期和拔节期Bt毒蛋白含量为叶片＞叶鞘＞茎秆＞根,孕穗期Bt毒蛋白含量为叶片＞叶鞘＞茎秆＞小穗＞根,抽穗期Bt毒蛋白在各个器官中表达量高低顺序变化不大,小穗含量稍有提高。到蜡熟期,成熟种子中几乎检测不到Bt毒蛋白含量,仅为1.95 ng∕g·FW。

秀水134-Bt的Bt基因由Rbcs3启动子驱动cry1Ac1（GenBank accession no.AY126450）的表达[5],Rbcs3启动子受光调控,具有绿色组织特异性,已经在水稻、番茄、棉花等植物上证明。本研究显示,不同生育期Bt毒蛋白在叶片中含量始终最高,测定结果与预期一致。从表1还可以看出,叶片中Bt毒蛋白含量整体表现为随着植株的生长而减少,在苗期叶片中Bt毒蛋白含量最高,为4300.97 ng∕g·FW,到蜡熟期表达量最低,下降到960.32 ng∕g·FW。这可能与Rbcs3启动子受光调控有关,到后期随着光照强度逐渐减弱,表达量也逐渐下降。

图1 秀水134-Bt及对照‘秀水134’对稻纵卷叶螟的抗性表现Fig.1 Resistance of Xiushui 134-Bt and‘Xishui 134’ to rice leaf roller

表1 秀水134-Bt毒蛋白的时空表达Table 1 The temporal and spatial expression of Bt toxin protein in Xiushui 134-Bt ng·g-1FW

3 讨论与结论

秀水134-Bt中Bt基因应用了绿色组织特异性启动子RBcs3来诱导,目前该启动子已经广泛应用到水稻、番茄、棉花、拟南芥、烟草等转基因植物中,该组织特异性启动子诱导表达基因只在茎叶等绿色组织中表达,使得蛋白产物富集于茎叶中,减少了在种子中的表达,可以提高消费者心理接受度,进一步提高了转基因水稻的产品安全问题。前期,本实验室已经对秀水134-Bt转基因水稻的主要营养成分、品质性状等进行了分析,发现其营养成分、品质性状、理化特性以及支链淀粉链长分布等均未发生明显改变[11-12]。

本研究进一步对秀水134-Bt不同时期不同器官中Bt毒蛋白的时空表达情况进行分析,结果显示叶片中Bt毒蛋白的表达量最高,叶片是螟虫危害的主要部位,Bt毒蛋白在叶片中表达量高更有利于杀死螟虫,达到较好的抗虫效果。同时Bt毒蛋白在水稻籽粒中表达量大大降低或者不表达,进一步证实了组织特异性启动子Rbcs3的作用,研究结果与Ye等[13]一致,为秀水134-Bt将来的商业化推广提供了依据。不同发育时期Bt毒蛋白表现为随着植株生长而减少,Bt毒蛋白以苗期和分蘖期的表达量最高,孕穗期和抽穗期明显下降,但仍然保持在较高的表达水平,到蜡熟期Bt毒蛋白表达量下降更加明显。因此,在水稻营养生长阶段的苗期或者拔节期对转基因进行检测分析可以提高检测准确性。本研究结果也为转基因抗虫水稻适宜检测时间选择提供了一定的参考。