不同仿野生栽培铁皮石斛多品质指标的比较

徐丽红，周 鑫，郑蔚然，黎天天，何中方，詹福云，白丽萍，王君虹

(1.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021； 2.乐清市中方润石斛有限公司，浙江 乐清 325600；3.乐清市雁荡山飞渡铁皮石斛研究所，浙江 乐清 325600)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)属兰科石斛属多年生草本植物，是我国传统的名贵中药，具有滋阴清热、益胃生津、免疫调节、延缓衰老等功效，常用于热病伤津、口干烦渴、病后虚热等病症[1-2]。近年来对铁皮石斛茎化学成分的研究已取得较大进展，有文献报道铁皮石斛中存在酚类及黄酮类化合物，多酚、黄酮是重要的抗氧化活性成分[3-5]。虽然铁皮石斛黄酮含量较低，但是黄酮类化合物是生物碱的一种，具有降血脂、抗血栓、抗氧化、降糖等多种生理活性，对于探究铁皮石斛的药用价值具有一定的参考作用[6-7]。由于铁皮石斛生长条件十分苛刻，自然产量极为稀少，更因民间长期过度采挖，致使野生资源濒临绝种[8]。国内从20世纪70年代开始规模化铁皮石斛人工仿野生栽培开发[9]，主要的人工栽培方式有大棚仿野生、活树仿野生、林下仿野生、死树仿野生、石头仿野生、岩壁仿野生等。2015年版《中华人民共和国药典》规定以多糖、甘露糖和醇溶性浸出物为质量标准进行品质控制[10]，传统以“质重，嚼之粘牙，口甜，无渣者为优”。不同栽培方式铁皮石斛药效含量的高低，已成为药农们关注的重点。近年来虽有对不同产区、不同种质、不同生长年限铁皮石斛多糖和单糖的研究报道[11-13]，也有对铁皮石斛茎和叶中多糖甘露糖含量的报道[14]，但未见不同仿野生栽培铁皮石斛多品质指标比较研究。本文通过对不同栽培方式下铁皮石斛多糖、甘露糖、多酚、黄酮、浸出物、粗纤维含量的测定，以纯野生铁皮石斛为对照，探索不同栽培方式下铁皮石斛药效成分含量的差异，为人工栽培优质铁皮石斛提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试样采自乐清市雁荡山铁皮石斛基地生产的活树仿野生、死树仿野生、大棚仿野生、石头仿野生、岩壁仿野生、林下仿野生栽培的铁皮石斛鲜茎，品种均为雁荡本地种，每种栽培方式采集3家企业生产的3份样品，每个植株采集1～2个二年生萌条，每份样品500 g，以药农采集的纯野生铁皮石斛作对照，经浙江省农业科学院鉴定为兰科植物铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)的茎。样品于102 ℃烘干后，经粉碎、干燥恒重后备用，样品由浙江省农科院质标所实验室检测。

1.2 仪器

Alliance-2695 高效液相色谱仪(美国Waters公司)；SPECORD 210 plus紫外-可见分光光度计(德国analytik jena公司)；分析天平(Sartorius感量0.1 mg)；SK5200HP 超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；XTERRA RP-18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；水浴锅(江苏金坛国旺实验仪器厂)；TDZ4A-WS低速离心机(湘仪公司)；Finnpipette移液器(Thermo公司)；旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)。

1.3 试剂

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、盐酸氨基葡萄糖(HAG)、氢氧化钠、三氯甲烷、乙酸铵、浓盐酸、苯酚、硫酸、乙醇、福林酚、碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、三氯化铝、乙酸钾均为分析纯；乙腈、甲醇为色谱纯；D-甘露糖(D-Man)和D-葡萄糖标准品为生化试剂；多酚(没食子酸)、黄酮(芦丁)对照品购自北京方程生物科技有限公司，水为娃哈哈纯净水。

1.4 检测方法

1.4.1 多糖含量测定

参照2010年版《中国药典》的方法[15]。

对照品溶液的制备。取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水溶解并定量制成每1 mL中含100 μg的溶液。

标准曲线的制备。精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL具塞试管中，加水至1.0 mL，精密加5%苯酚溶液1 mL，摇匀，再精密加硫酸5 mL，摇匀，置沸水浴中加热20 min，取出放入冰浴中冷却5 min，以相应的试剂为空白，用紫外-可见分光光度法在488 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

供试品溶液的制备。取样品粉末(过3号筛)约0.3 g，精密称定，加水200 mL，加热回流提取2 h，提取液转移至250 mL量瓶中，用适量水分次洗涤容器，洗液转移至同一量瓶中，冷却，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2 mL，置25 mL离心管中，精密加入无水乙醇10 mL，摇匀，冷藏1 h，取出，离心(4 000 r·min-1)20 min，弃去上清液(必要时滤过)，沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次8 mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解并转移至25 mL量瓶中，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

测定。精密量取供试品溶液1 mL，置10 mL具塞试管中，按照标准曲线制备项目下的方法，自“精密加5%苯酚溶液1 mL”起，依方法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的量，并进行计算。

1.4.2 甘露糖含量检测

参照2010年版《中国药典》中高效色谱法(附录Ⅵ D)[15]。

内标溶液的制备。取盐酸氨基葡萄糖适量，精密称定，加水制成每1 mL含0.1 mg的溶液。

对照品溶液的制备。取甘露糖对照品约10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，精密加入内标溶液1 mL，加水适量使溶解，用水定容至刻度，摇匀。

供试品溶液的制备。取样品粉末(过3号筛)0.100 0 g，精密称定，加80%乙醇索氏提取4 h，弃去乙醇液，药渣挥干乙醇，滤纸筒拆开后置于烧杯中，加水100 mL，精密加入内标溶液2 mL，煎煮并时时搅拌，煎煮1 h，放冷，加水补至约100 mL，混匀，滤过，取续滤液1 mL置于安瓿瓶或顶空瓶中，加入3.0 mol·L-1的盐酸溶液0.5 mL，封口，混匀，110 ℃水解1 h。冷却后，开封，用3.0 mol·L-1的氢氧化钠溶液调节pH值至中性。

测定。取对照品溶液与供试品溶液各1.0 mL，分别加0.5 mol·L-1的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液与0.3 mol·L-1的氢氧化钠溶液各400 μL，混匀，70 ℃水浴反应100 min。再加0.3 mol·L-1的盐酸溶液500 μL，用三氯甲烷洗涤3次，每次2 mL，弃去三氯甲烷液，水层离心(4 000 r·min-1)10 min后收集上清液，即得供试品溶液。取上清液10 μL，注入高效液相色谱仪进行测定。

色谱条件与系统适用性试验。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.02 mol·L-1的乙酸铵溶液(20∶80)为流动相，检测波长为250 nm。

1.4.3 醇溶性浸出物含量测定

参照2010年版《中国药典》(附录X A)醇溶性浸出物测定法[15]。

取供试样品粉末2.000 g放入蒸馏瓶中，加入100 mL 95%乙醇溶液浸提1 h，称取蒸馏瓶质量并记录m1，在沸水浴中回流提取1 h，取出冷却，称取蒸馏瓶质量加水补充至与m1一致，过滤。吸取滤液20 mL于烘至恒重且已知质量的蒸发皿中，于沸水浴上蒸干，转移至烘箱中105 ℃烘3 h，取出至干燥器中冷却称重。

ω=100(m2-m1)/m。

式中，ω为试样中浸出物含量(%)；m为样品质量(g)；m1为蒸发皿质量(g)；m2为烘干后蒸发皿质量(g)。

1.4.4 多酚含量测定

参照ISO 14502.1—2005绿茶和红茶的物质特性测定 第一部分 茶中总多酚的含量-Folin-Ciocalteu试剂的比色法(GB/T 8313—2008)[16]。

试液的制备。称取0.200 0 g均匀磨碎的试样于10 mL离心管中，加入在70 ℃中预热过的70%甲醇溶液5 mL，用玻璃棒充分搅拌均匀湿润，立即移入70 ℃水浴中，浸提10 min(隔5 min搅拌1次)，浸提后冷却至室温，转入离心机在3 500 r·min-1转速下离心10 min，将上清液转移至10 mL容量瓶。残渣再用5 mL 70%甲醇溶液提取1次，重复以上操作。合并提取液定容至10 mL，摇匀。再移取1.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，待测。

试液的测定。用移液管分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL没食子酸工作液(1 000 μg·mL-1)1.0 mL于刻度试管内，在每个试管内分别加入5.0 mL的福林酚试剂，摇匀。反应3～8 min，加入7.5%碳酸钠溶液4.0 mL，加水定容至刻度，摇匀。室温下放置60 min，在765 nm波长条件下用分光光度计测定吸光度。根据没食子酸工作液的吸光度与各工作溶液的没食子酸浓度，制作标准曲线。同时用水作空白对照，765 nm波长条件下测定测试液及空白对照的吸光度，将其代入标准曲线方程计算出茶多酚的浓度。

1.4.5 黄酮含量测定

参照NY/T 1295—2007荞麦及其制品中总黄酮含量的测定[17]。

试液的制备。称取试样1.000 0 g，置于15 mL具塞三角瓶中，加入甲醇溶液30 mL，盖紧瓶盖，将三角瓶置于(65±2)℃的恒温水浴振荡器中在(160±10)r·min-1的振荡频率下振摇2 h，趁热过滤，滤液置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶液清洗滤纸和残渣，合并滤液，冷却至室温，加甲醇溶液至刻度，摇匀，为试料待测液。

标准曲线的绘制。准确吸取芦丁标准溶液0、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mL(相当于芦丁0、12.5、25、50、100、150 μg·mL-1)，移入10 mL刻度比色管中，加入30%乙醇溶液至5.0 mL，各加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，振摇后放置5 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，振摇后放置6 min，加1.0 moL·L-1氢氧化钠溶液2 mL，30%乙醇溶液定容至刻度，以零管为空白，摇匀后用1 cm的比色杯在510 nm的波长处测定吸光度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线或求取线性回归方程。

试液的测定。准确吸取1.0 mL待测液置于10 mL容量瓶中，分别加入三氯化铝溶液2 mL、乙酸钾溶液3 mL，用甲醇溶液定容至刻度，摇匀，室温下放置30 min。在4 000 r·min-1速度下离心10 min。于波长420 nm处测定吸光度值，将其代入标准曲线方程计算出总黄酮的浓度。

1.4.6 粗纤维含量检测

参照茶粗纤维测定GB/T 310—2002[18]。

称取样品(18目)约为1 g，准确至0.000 2 g，置入玻璃坩埚中，先用乙醚脱脂。把装有样品的坩埚放入福斯2010纤维测定仪加热槽。打开电源开关，再开启循环水加热开关，至水灯亮，然后开启酸加热开关，至酸灯亮。

加入150 mL左右浓度为1.25%的热硫酸，打开加热电源使酸微沸，加热回流时间为30 min，酸处理完成后必须用水彻底清洗样品管中的样品，使之呈中性。然后开启碱加热开关至碱灯亮，加入150 mL左右浓度为1.25%的氢氧化钠，打开加热电源使碱微沸，加热回流时间同样为30 min，碱处理完成后用水彻底清洗用品管中的样品。将水滤尽，取出并用95%乙醇淋洗，然后放入105 ℃烘箱中烘4 h至恒重，冷却后称量。将干燥后的样品放入550 ℃高温炉(马福炉)中灰化2.5 h，至恒重，冷却30 min后称量。

1.5 数据统计与分析

利用Excel 2003对数据进行整理，SPSS 17.0软件进行单因素方差分析和Duncan新复极差测验的多重比较。

2 结果与分析

2.1 多糖含量

由表1可知，不同栽培方式铁皮石斛多糖含量(以干基计)为28.62%～48.73%，平均含量35.12%，含量最高的是石头仿野生和林下仿野生栽培的铁皮石斛，分别为48.73%和44.15%，两者间无显著性差异，但极显著地高于其他栽培的铁皮石斛，其中纯野生、大棚仿野生、岩壁仿野生、活树仿野生栽培铁皮石斛多糖含量之间也无显著差异。多糖含量最低的是死树仿野生栽培的铁皮石斛，为28.62%。所有栽培方式铁皮石斛多糖含量均符合2015版《中国药典》规定的按干燥品无水葡萄糖(C6H12O6)计的不少于25.0%。

表1 不同栽培方式铁皮石斛成分含量

注：同列无相同大小写字母分别表示差异达极显著和显著水平。

2.2 甘露糖含量

由表1可知，不同栽培方式铁皮石斛甘露糖含量(以干基计)为19.08%～28.07%，平均含量23.01%。含量最高的是石头仿野生和林下仿野生栽培的铁皮石斛，分别为28.07%、26.45%，极显著地高于大棚仿野生、岩壁仿野生、死树仿野生、纯野生、活树仿野生栽培。所有栽培方式铁皮石斛甘露糖含量均符合2015版《中国药典》规定的按干燥品甘露糖含量(C6H12O6)应为13.0%～38.0%。

2.3 浸出物含量

由表1可知，不同栽培方式铁皮石斛醇溶性浸出物(以干基计)含量为4.04%～16.05%，平均含量7.21%，含量最高的为纯野生铁皮石斛，达16.05%，极显著地高于其他栽培方式。其次为岩壁仿野生、活树仿野生栽培方式，浸出物含量分别是6.53%和6.16%，极显著地高于林下仿野生、石头仿野生和死树仿野生栽培方式。浸出物含量之间无显著差异，浸出物含量最低的是死树仿野生栽培方式，为4.04%。只有纯野生、岩壁仿野生栽培铁皮石斛浸出物含量符合2015版《中国药典》规定的醇溶性浸出物含量不得少于6.5%。

2.4 多酚含量

由表1可知，不同栽培方式铁皮石斛多酚含量(以干基计)为0.31%～0.66%，平均含量0.43%，含量最高的是纯野生铁皮石斛，为0.66%，极显著地高于其他栽培方式。其次为活树仿野生栽培的铁皮石斛，多酚含量为0.51%，极显著地高于岩壁仿野生、林下仿野生、石头仿野生、死树仿野生栽培的铁皮石斛。多酚含量最低的是大棚仿野生栽培铁皮石斛，为0.31%。黄琴等[20]研究表明，铁皮石斛4个不同极性提取物均具有较强的体外抗氧化活性，且各提取物抗氧化活性与总酚含量和总黄酮含量之间有明显的相关性，表明铁皮石斛抗氧化活性的物质基础可能就是酚类或黄酮类成分，说明铁皮石斛药材的质量，纯野生者质量优于人工栽培的。

2.5 黄酮含量

由表1可知，不同栽培方式铁皮石斛黄酮含量(以干基计)为0.09%～0.25%，平均含量0.16%；含量最高的是纯野生栽培的铁皮石斛，为0.25%，极显著地高于其他栽培方式。其次为林下仿野生、岩壁仿野生栽培的铁皮石斛，含量分别为0.17%和0.16%，显著地高于活树仿野生、死树仿野生、石头仿野生栽培的铁皮石斛。黄酮含量最低的是大棚仿野生栽培铁皮石斛，为0.09%，说明铁皮石斛药材的质量，以纯野生者质量优于人工栽培。

2.6 粗纤维含量

由表1可知，不同栽培方式铁皮石斛粗纤维含量(以干基计)9.63%～16.49%，平均含量11.69%，含量最低的是石头仿野生、死树仿野生、林下仿野生栽培铁皮石斛，分别为9.63%、9.76%、9.85%；含量最高的是纯野生铁皮石斛，为16.49%，极显著地高于其他栽培方式。其次为活树仿野生栽培的铁皮石斛，含量为13.29%，显著地高于其他栽培方式，说明所有人工栽培的铁皮石斛粗纤维含量均较纯野生的要低得多。这是因为纯野生的铁皮石斛生长于人迹罕至的悬崖峭壁上阴面崖缝间，根不入土，常年饱受云雾雨露滋润，生长年限长，纯野生铁皮石斛质地结实，粗纤维含量最高。

3 小结

多糖是铁皮石斛的主要有效成分，多糖成分能够清除自由基，具有抗氧化活性。石头仿野生和林下仿野生栽培的铁皮石斛多糖和甘露糖含量极显著地高于其他栽培方式。不同仿野生栽培铁皮石斛多糖、甘露糖含量均符合2015版中国药典的规定，说明不同人工栽培方式生产的铁皮石斛均可替代野生铁皮石斛。不同栽培方式下铁皮石斛粗纤维含量最高的是纯野生铁皮石斛，极显著地高于其他栽培方式。含量最低的是石头仿野生、死树仿野生、林下仿野生栽培的铁皮石斛。石头仿野生和林下仿野生栽培的铁皮石斛多糖和甘露糖含量高、粗纤维含量低，说明纯野生铁皮石斛的生态环境不如人工栽培的优越，石头仿野生和林下仿野生栽培生态环境更接近纯野生且营养状况又优于纯野生，比较适合铁皮石斛多糖和甘露糖含量的积累。

不同栽培方式铁皮石斛醇溶性浸出物(以干基计)含量最高的是纯野生铁皮石斛，达16.05%，极显著地高于其他任何栽培方式；其次为岩壁仿野生、活树仿野生栽培，极显著地高于大棚仿野生栽培、林下仿野生、石头仿野生和死树仿野生栽培，含量最低的是死树仿野生栽培方式。

不同栽培方式铁皮石斛多酚和黄酮含量最高的也均是纯野生铁皮石斛，极显著地高于其他栽培方式；多酚和黄酮含量最低的均是大棚仿野生栽培铁皮石斛，说明大棚仿野生栽培的铁皮石斛在醇溶性浸出物、多酚和黄酮含量上与纯野生铁皮石斛仍存在极显著差异，有较大的提升空间，很多栽培措施有待进一步的深入研究。