活血化瘀方对盆腔炎性疾病大鼠血管内皮因子及免疫因子的影响

齐惠莉，王烈宏

1. 青海省海西州人民医院妇产科(海西817000)，2.青海省红十字医院妇产科(西宁 810000)

主题词 盆腔炎性疾病/中医药疗法 @活血化瘀方 动物实验 大鼠 血管内皮生长因子 免疫因子

盆腔炎性疾病(Pelvic inflammatory disease,PID)是因上生殖道发生感染而继发的一系列炎性病变，常见的有盆腔腹膜炎、子宫内膜炎、输卵管炎、输卵管及卵巢脓肿等[1-3]。本病以女性的内生殖器、盆腔腹膜及周围结缔组织等发生炎性反应为主要临床表现。多由急性盆腔炎而继发，在长期炎症环境作用下使疾病迁延难愈[4-6]。PID是育龄女性中的一种常见疾病，如未能给予及时、规范、有效的治疗，可能导致异位妊娠、不孕、盆腔慢性疼痛、炎症反复发作等一系盆腔炎性疾病的后遗症。中医治疗本病历史悠久、经验丰富，具有独到优势。活血化瘀法符合本病的病机与治疗原则，为了研究其治疗本病的机理并为临床用药积累试验数据，本院特开展本次研究。现将具体研究情况于后文内作详尽阐述。

资料与方法

1 材 料 ①自西安交通大学动物中心购进， SPF级未孕的成年SD雌性大鼠80只，年龄为10～14周，平均(12.16±1.62)周；体重为(180～220) g，平均(203.46±19.78) g；许可证号为SCXK(陕)2018-003；同时购买大鼠专用常规饲料。②造模菌株，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌，均购自中国医学细菌保藏中心。③药材，本次治疗依据中医活血化瘀法拟定活血化瘀方进行治疗，方剂组成：当归、桃仁、丹参各20 g，白芍、苏梗、蒲黄各10 g，香附、枳壳、大黄、牡丹皮、五灵脂各5 g，炙甘草3 g。一剂以500 ml凉水浸泡30 min后，使用中药房煎药机煎至约300 ml药液备用。均购自同仁堂中药饮片公司。

2 实验方法

2.1 菌液制备:将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌三项菌株，分别配制为4.5×109CFU/ml菌液，将三项菌液按2∶1∶1的比例配制为建模感染源菌液。

2.2 分组与建模:将购买的80只大鼠均分为空白对照组(后简称对照组)、模型组、阳性药物组(后简称阳性组)、观察组4个组，每组各20只。对照组大鼠正常喂养，其他三组大鼠均制备为盆腔炎性疾病动物模型。

购进后进行适应性喂养，7 d后造模。除对照组外其余三组共60只大鼠，均以10%的水合氯醛进行麻醉，于鼠下腹部的正中处做0.8～1.0 cm的切口，开腹，分离肠管并充分显露子宫，使用1 ml注射器的针头对右侧子宫内膜做机械性划伤，于划伤处注入1 ml的感染源菌液，左侧子宫不做机械划伤与菌液注射；关腹。术后常规喂养2周，均不给予任何治疗。建模2周后，观察大鼠阴道分泌物增多，饮食量下降，精神萎靡不振为建模成功[7]。

2.3 治疗方法:对照组持续正常喂养4周。模型组于建模成功后常规喂养，不予任何治疗，持续4周。阳性组于建模成功后给予1 ml饮用蒸馏水灌胃，每日早晚各1次，持续4周。观察组，于建模成功后给予1 ml药液灌胃，每日早晚各1次，持续4周。

3 观察方法 喂养或治疗4周为1个疗程，1个疗程后，观察组取大鼠腹主动脉血3 ml，使用离心机按3000 r/min速度离心后，取得血清，以ELISA法检测血清中免疫因子：白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-1β、白细胞介素-8(IL-8)与炎性因子：单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)的表达水平。

处死大鼠，摘取双侧的子宫、输卵管、卵巢，除去脂肪组织后称量、记录置于10%的甲醛固定液当中保存。按公式：左侧子宫质量-左侧子宫质量计算子宫肿胀度。取固定后的子宫与卵巢组织，经脱水、透明处理后制备为石蜡包块，将包块制备为4～5μm厚度的石蜡切片，置于载玻片上，于60℃的烤箱内过夜；再行脱蜡、水化。以免疫组化法(SABC)检测VEGF表达水平；使用Motic 3000型显微摄影系统400倍下摄片，以Image pro plus 病理图像处理系统作定量分析，读取3个高倍镜视野内的积分光密度(IOD)值，以均值为VEGF的相对表达量。染色阳性标准为黄色、黄棕色。

4 统计学方法 使用SPSS 21.0软件对研究数据进行统计学分析，各组数据对比均使用One-Way ANOVA分析，进一步两两对比使用LSD-L分析；以P<0.05为差异具有统计学意义标准。

结 果

1 各组VEGF表达比较 见表1。各组子宫内膜VEGF、卵巢组织VEGF的表达水平具有统计学差异(P<0.05)；经进一步两两对比分析，模型组与阳性组的表达水平无统计学差异(P>0.05)，其他各组两两对比均具有统计学差异(P<0.05)。

表1 各组VEGF表达水平统计比较(ng/ml)

注：与对照组比较，☆P<0.05；与模型组比较，★P<0.05；与阳性组比较，◇P<0.05

2 各组血清免疫因子比较 见表2。各组间血清免疫因子表达水平具有统计学差异(P<0.05)；经进一步两两对比分析，模型组与阳性组各项免疫因子的表达水平均无统计学差异(P>0.05)，其他各组两两对比均具有统计学差异(P<0.05)。

表2 各组血清免疫因子表达水平比较

注：与对照组比较，☆P<0.05；与模型组比较，★P<0.05；与阳性组比较，◇P<0.05

3 各组血清炎性因子比较 见表3。各组间血清炎性因子表达水平具有统计学差异(P<0.05)；经进一步两两对比分析，模型组与阳性组各项炎性因子的表达水平均无统计学差异(P>0.05)，其他各组两两对比均具有统计学差异(P<0.05)。

表3 各组血清炎性因子表达水平比较(pg/ml)

注：与对照组比较，☆P<0.05；与模型组比较，★P<0.05；与阳性组比较，◇P<0.05

4 各组子宫肿胀度比较 见表4。各组左侧子宫质量无统计学差异(P>0.05)；各组间右侧子宫质量、子宫肿胀度具有统计学差异(P<0.05)；经进一步两两对比分析，模型组与阳性组右侧子宫质量、子宫肿胀度均无统计学差异(P>0.05)，其他各组两两对比右侧子宫质量、子宫肿胀度均具有统计学差异(P<0.05)。

表4 各组血清炎性因子表达水平比较( pg/ml)

注：与对照组比较，☆P<0.05；与模型组比较，★P<0.05；与阳性组比较，◇P<0.05

讨 论

PID是一种女性常见疾病，可累及生殖系统、腹腔、盆腔等诸多器官、组织，病情迁延难愈，复发率高[8-10]。PID作为一种感染病原体诱使盆腔组织、生殖系统等炎症应激反应，并长期维持炎症反应，并通过淋巴系统、血流系统等逐渐向外浸润，引起广泛性炎症反应[11-13]。而病灶局部在长期炎症反应的作用下逐渐形成血流动力障碍、组织代谢功能减弱。PID的进展与免疫病理损伤及诸多炎性细胞因子的异常升高表达相关。MCP-1为前炎性因子，具有诱导内皮细胞、单核细胞活性的作用，可促进炎性细胞汇聚从而促进炎症反应、加大炎性反应范围。ICAM-1为免疫球蛋白超家族的重要成员，能够介导白细胞及其因子与内皮细胞间的黏附，从而导致平滑肌增生，形成组织损伤，促进炎症反应进程。TNF-α是一种重要的免疫调节因子与炎性促进因子，在炎症的应激反应过程中起到核心性作用。炎症反应初期时TNF-α能够起到免疫调节功效，提高机体的抗感染能力，同时TNF-α可刺激内皮细胞生成黏附因子，从而诱导炎性介质的合成，诱发子宫形成病理性损伤。白细胞介素系列是重要的免疫因子，与免疫球蛋白超家族为同一受体，主要由T淋巴细胞合成，IL-10为免疫调节因子，IL-1β、IL-8均为免疫应激因子，正常状态下IL-10与IL-1β、IL-8形成免疫平衡，当机体发生感染与炎性反应时，可发生免疫紊乱或过度免疫，而使免疫平衡被打破，IL-10表达水下降，IL-1β、IL-8表达水平上升。炎症反应下组织及血管的通透性升高，使诸多炎症因子、免疫因子迅速升高入血，从而导致其在血清中的表达水平发生异常改变。PID患者的长期炎症反应可刺激VEGF升高表达，而形成炎症局部血管、组织等发生增生、扭曲且弹性张力下降，从而诱发一系列肿胀、破溃、损伤等病变。因此，血清中的免疫因子、炎性因子与子宫内膜、卵巢组织中VEGF的表达水平能够客观的反应PID患者的病情程度，亦可对治疗效果的正确评估提供精准指导。

本病属祖国医学的月经、带下病、不孕、淋浊、腹痛、癥瘕积聚等病范畴。多由于脾虚湿聚，肝气不舒、血滞成瘀，痰湿血瘀互结，是形成盆腔炎的病理产物。活血化瘀法为活血生新、化瘀逐瘀为基础，兼祛湿清热是治疗盆腔炎的主要大法[14-15]。本院以活血化瘀法为论理基础，自拟活血化瘀汤治疗本病。方中当归性温，味甘、辛。归心、肝、脾经；有活血补血、调经止痛,润肠通便作用。桃仁性平，味苦；归心肝经和肺与大肠经。桃仁有活血化瘀、祛瘀，润肠通便作用，多用于瘀血而形成的癥瘕痞块、便秘等症。丹参性微寒、味苦，归心、肝经，具有活血化瘀、养血安神、凉血消痈功效，用于月经不调、心腹瘀血疼痛，积聚、癥瘕，风湿热痹，肿痛疮疡，心悸，失眠，烦躁不宁。白芍性微寒，味酸、苦，归肝脾经，有养血柔肝、敛阴止痛，平抑肝阳作用，主要用于月经不调，崩漏，虚汗淋漓，脘腹拘挛急痛，胁肋胀痛。苏梗性温，味辛，归肺、脾经，有理气宽中，行气化湿、止痛作用，多用于气郁引起的胸膈痞闷，胃脘胀痛，嗳气泛恶等。蒲黄性平，味甘，归心包经、肝经，有活血化瘀，止血，通淋作用，多用于吐、衄血，尿血，崩漏，心腹瘀血作痛，血淋尿道涩痛、产后少腹瘀痛。香附性平，味辛、微甘苦，归三焦肝经；具有疏肝理气，调经、止痛功效，常用于肝气不舒的胁肋疼痛，乳房胀痛、月经不调、脘腹、疝气作胀疼痛。枳壳性微寒，味微辛、酸苦，归脾胃、肺大肠经，有化痰、祛湿消积、理气宽中作用，由于该药气香性散、降中有升，可治疗胸膈痞闷，胁肋胀痛，痰滞食积所致脘腹胀满，泻痢后重等。大黄性寒，味苦，归肝、脾、胃、大肠、心包经，其功效为泻下攻积、推陈致新，清热泻火,凉血、活血、解毒、祛瘀；现代药理研究表明：大黄的抗感染、抗氧化作用很强，具有抗炎、解热调节免疫作用，对于多种病原微生物有很好的抑制、杀灭作用。牡丹皮性微寒，味苦、辛，归肝、肾经、心经，具有活血化瘀、清热凉血、退虚热、血热等功效，可用于热入营血所致的经闭痛经、血热发斑等症,现代药理研究显示牡丹皮有镇痛、抗惊厥、抗过敏、解热、抗菌、消炎作用。五灵脂性温、味甘，入肝经，有散瘀止痛、通利血脉，祛瘀止血功效；对于一切气滞血瘀疼痛之证均有良好的止痛效果，其止痛之功与乳、没不分上下。炙甘草补气和中、调和诸药。

本次研究结果表明，观察组血清免疫因子表达水平优于模型组与阳性组，但与对照组仍具有统计学差异；提示活血化瘀法可有效改善PID大鼠的免疫应激状态，但一个疗程的治疗仍无法恢复到正常大鼠水平。观察组炎性因子优于模型组与阳性组，与对照组亦具有统计学差异性，说明活血化瘀方可有效改善PID大鼠的炎症程度，虽尚未达到正常大鼠水平，但可通过延长疗程提高治疗效果。各组大鼠的子宫肿胀度均高于对照组，但观察组低于模型组与阳性组，提示活血化瘀法可改善PID大鼠子宫肿胀程度、降低炎症反应。通过对比各组大鼠子宫与卵巢的VEGF水平可知，活血化瘀法可有效改善PID大鼠子宫与卵巢组织中的VEGF表达，从而起到控制病情进展、抑制炎性反应的作用。