粉碎细度与滤袋对饲草NDF与ADF含量的影响

2018-07-28，，，，

草地学报 2018年2期

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(1.山东省畜牧总站，山东省草产品质量检测中心，山东济南 250022； 2. 山东晟益牧业有限公司，山东济南 250121)

1963年，Van Soest提出了用中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)替代粗纤维(crude fiber，CF)作为评定饲草中纤维类物质的指标，以准确反映饲草中纤维的可消化利用程度[1]。我国先后颁布的豆科牧草干草(Legume hay)、苜蓿干草捆(Bale of alfalfa hay)、草颗粒(Forage pellet)、草块(Forage cubes)和青贮玉米(Silage maize)质量分级标准均把NDF或NDF和ADF作为质量分级参数，同时中国饲料原料数据库饲料常规养分表也自2000年引入这两项指标，因此NDF和ADF快速准确测定已成为判定饲草质量等级和科学配置牛羊日粮的重要前提[2-3]。

我国于2006年和2007年先后颁布了国家标准GB/T20806—2006和行业标准NY/T1459—2007，分别规范了饲料中NDF和ADF含量的测定，其操作方法均为抽滤法。但该方法操作过程控制难、耗时长，尤其是抽滤过程常常因样品堵塞过滤眼而延长检测时间、影响样品清洗程度，造成检测效率低、误差大[4]。为了提高检测效率和精确度，自上个世纪90年代以来，滤袋法检测技术被逐步研究与应用[5]，1993年美国ANKOM科技公司推出ANKOM纤维分析仪，实现了滤袋法检测技术的全自动化操作。

影响滤袋法测定结果的两个重要因素是样品的粉碎细度与滤袋，两者紧密相关。研究发现[6-7]，样品粉碎越细，NDF和ADF含量越低，田雨佳等[4]认为这是样品微粒流出滤袋造成的，并建议样品粉碎细度为9目(2.00mm)，但未给出滤袋孔径大小参数。而Vogel等[8]和薛红枫等[9]采用ANKOM公司 F57滤袋 (孔径为25μm)测定粉碎细度为18目(1.00mm)的试样，其NDF与ADF含量与国标法差异不显著。目前市场推出了更小孔径的滤袋，如ANKOM F58滤袋(孔径为10μm)，而相应的样品粉碎细度参数研究未见报道。另外，一些学者对不同材质的纤维滤袋[9]、尼龙布滤袋[7, 10]、聚酯布滤袋[11]等在NDF和ADF测定中的应用做出了有益的探索，但由于样品、检测方法的不同，结果并不一致。本试验就粉碎细度、滤袋材质和孔径大小对滤袋法测定饲草中NDF和ADF含量的影响进行了研究，以期为滤袋法测定饲草NDF和ADF含量提供粉碎细度参数和滤袋筛选依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

取自山东省内草捆、草粉、草颗粒和青贮饲料4大类10种饲草为试验样品。

1.2 试验设计与方法

1.2.1不同粉碎细度处理设计9目(2.00 mm)、18目(1.00 mm)和40目(0.45 mm)3个粉碎细度处理，每个处理3次重复，用ANKON F58纤维滤袋(特制无纺布、孔径10 μm、ANKOM公司提供)测定不同粉碎细度下10种饲草NDF和ADF含量。同时，将试验样品装入ANKON F58纤维滤袋，用蒸馏水浸泡，测定样品微粒流失率、溶水率和总失重率。

1.2.2不同滤袋处理选择聚酯布、尼龙布和无纺布3种材质制作成滤袋，聚酯布分国产和进口，孔径为400目(37 μm)、600目(23 μm)、800目(18 μm)，尼龙布孔径为400目、800目、1200目(12 μm)、1600目(10 μm)，无纺布为孔径400目普通无纺布(国产聚酯布、尼龙布和无纺布均由浙江中科环保滤料有限公司提供；进口聚酯布为ANKOM technology, Macedon, NY, USA生产)、CAU滤袋[7](特制无纺布、孔径20 μm、中国农业大学肉牛研究中心提供)和ANKON F58纤维滤袋。不同材质和孔径滤袋共13个处理，每个处理3次重复，以ANKON F58纤维滤袋为对照，测定苜蓿干草捆样品(过40目网筛)NDF和ADF含量。

1.2.3样品制备采集的草捆、草粉、草颗粒先用铡草粉碎机粗粉，再用实验室用样品粉碎机(HK-08B，广州市旭朗机械设备有限公司)细粉至过9目、18目和40目网筛，充分混合后用四分法缩分至100 g，装袋，为试验样品。青贮饲料先用电热恒温鼓风干燥箱在65℃下烘干24 h，再按上述方法粉碎、缩分、装袋，制成试验样品。

1.2.4滤袋的制作裁剪普通无纺布、聚酯布和尼龙布，用封口机(AIE-200，美国通用电气公司)压制成5 cm×6 cm的滤袋，样品装入后用封口机封口。

1.3 测定项目与方法

1.3.1仪器与试剂全自动纤维分析仪：ANKOM 2000i，美国ANKOM技术有限公司。

离心机：DT5-2，北京时代北利离心机有限公司。

电热鼓风干燥箱：DHG-9123A，上海精宏实验设备有限公司。

耐高温α-淀粉酶及稀释液：100℃±5℃温度下活性为8 000 U·g-1，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。8.0 mL α-淀粉酶加水稀释至250 mL，配成α-淀粉酶稀释液。

中性洗涤剂：18.61 g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、 6.81 g四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)、4.56 g 无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)、30.00 g十二烷基硫酸钠(USP)各自加适量温水溶解，冷却后混合，加入10 mL三甘醇(C6H14O4)或乙二醇乙醚(C4H10O2)，加水定容至1 000 mL。

酸性洗涤剂：20.00 g十六烷基三甲基溴化铵，溶解于1 000 mL 0.05 mol·L-1硫酸溶液中，适当加热，搅拌溶解。

1.3.2失重率的测定称取烘干试样0.5 g，装入烘干并称重和标号的滤袋，封口；放入烘干并称重和标号的80 mL塑料离心管，移入50 mL蒸馏水，振荡2 h；取出滤袋，在102℃±2℃下烘干至恒重，称重，计算样品失重率；离心管在2800×g离心力下离心5 min，倒去上清液，在102℃±2℃下烘干至恒重，称重，计算样品微粒流失率；用样品失重与微粒失重之差与样品重的比值，计算样品溶水率。

1.3.3NDF的测定称取烘干试样0.5 g，装入滤袋，封口。置于烧杯中，加入丙酮浸泡振荡洗涤3次，风干后置入全自动纤维分析仪滤袋架。自动加入中性洗涤液2 000 mL，手动加入20 g无水亚硫酸钠，100℃ 消煮1 h，70℃ 温水冲洗4次，滤袋移入烧杯，丙酮浸泡3～5 min，取出晾干，在102℃±2℃下烘干至恒重，称重，计算样品NDF含量。置入空白滤袋参与全部操作过程，计失重比例为校正因子。全株玉米青贮饲料样品在消煮时加入4.0 mL ɑ-淀粉酶，并在热水洗涤时加入250 mL ɑ-淀粉酶稀释液。

1.3.4ADF的测定采用连续法测定ADF的含量。将测定NDF后的滤袋重新放入全自动纤维测定仪滤袋架，自动加入酸性洗涤剂2 000 mL，100℃消煮1 h，70℃温水冲洗4次，滤袋移入烧杯，丙酮浸泡3～5 min，取出晾干，在102℃±2℃下烘干至恒重，称重，计算样品ADF含量。置入空白滤袋参与全部操作过程，计失重比例为校正因子。

1.4 数据分析

试验数据采用SPSS 21.0统计软件进行单因素方差分析，用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同粉碎细度处理的失重率

9目、18目和40目粉碎细度下样品在F58滤袋中的失重率见图1。由图显示，样品粉碎细度从9目增加至40目，微粒流失率、溶水率和总失重率均无显著性差异，变化范围分别为1.37%～1.86%、12.07%～12.69%和13.68%～14.55%。表明，F58滤袋可有效阻止样品微粒的流失。

2.2 不同粉碎细度处理的NDF含量

10个饲草样品经过9目、18目和40目粉碎细度处理后的NDF含量见图2。NDF含量最高的是小麦秸秆和豆秸，达到70%以上。其次是羊草干草、玉米秸秆青贮饲料、地瓜秧、花生秧和燕麦干草，范围是50%～70%，苜蓿干草和玉米秸秆在40%～50%，最低的是全株玉米青贮饲料，低于40%。

苜蓿干草、豆秸和花生秧3个样品不同细度处理间NDF含量差异不显著，其它7个样品的NDF含量表现为9目处理显著高于18目处理和40目处理(P<0.05)。除小麦秸秆18目处理NDF含量显著高于40目处理外(P<0.05)，其它9个样品18目处理和40目处理间的差异不显著。

图1 不同粉碎细度处理的失重率Fig.1 weight losses ratio of dry matter under different treatments

2.3 不同粉碎细度处理的ADF含量

10个饲草样品经过9目、18目和40目粉碎细度处理后ADF含量见图3。样品ADF含量变化与NDF含量关系密切，由高到低依次为豆秸>小麦秸秆、花生秧、地瓜秧>羊草干草、玉米秸秆青贮饲料、苜蓿干草>燕麦干草、玉米秸秆、全株玉米青贮饲料。

粉碎细度处理对样品ADF含量影响不如对NDF含量影响明显，10个样品中有6个样品各处理间差异不显著。具体表现为羊草干草、玉米秸秆青贮饲料、小麦秸秆和地瓜秧4个样品9目处理的ADF含量显著高于18目和40目(P<0.05)，玉米秸秆青贮饲料和地瓜秧2个样品的ADF含量18目显著高于40目(P<0.05)，其它样品各处理间差异不显著。

图2 不同粉碎细度处理的NDF含量Fig.2 NDF content of sample under different finenesses

图3 不同粉碎细度处理的ADF含量Fig.3 ADF content of sample under different finenesses

2.4 不同滤袋处理的NDF和ADF含量

不同材质和孔径滤袋处理，样品NDF和ADF含量见表1。表中数据显示， CAU滤袋测定样品的NDF和ADF含量与F58滤袋(CK)差异不显著，表明，CAU滤袋与F58滤袋材质相同，孔径均较小，在本试验测定方法中可以替代使用。其它滤袋测定的NDF含量均与CK处理差异显著(P<0.05)，ADF含量除尼龙布1 200目和1 600目处理与CK差异不显著外，其它处理也均与CK处理差异显著(P<0.05)。表明，普通无纺布、聚酯布和尼龙布均不能在本试验测定方法下代替F58滤袋使用。

聚酯布和尼龙布滤袋不同孔径处理NDF和ADF含量均呈随目数增加而增加的趋势。普通无纺布处理NDF含量与聚酯布和尼龙布的400目处理差异不显著，ADF含量与聚酯布和尼龙布10个处理的7个处理无显著性差异。

表1 不同滤袋测定的NDF和ADF含量Table 1 NDF and ADF contents of samples under different filter-bags

注：表中数据为平均值±标准差(n=3)。同列数字后不同字母表示差异显著(P<0.05)

Note: Mean±standard deviation (n=3).The different letters within the same column mean the significant differences at the 0.05 level

2.5 不同处理的滤袋破损率

13个滤袋处理在NDF含量测定过程中未发现滤袋破损现象，而ADF含量测定后发现有8个处理出现滤袋破损情况(见表2)，为封口内缘断裂。破损滤袋材质均为聚酯布和尼龙布，且呈现随目数增加而增加的趋势。滤袋破损率变化范围为0～100%，其中600目和800目进口聚酯布处理破损率为100%，尤以800目进口聚酯布滤袋处理破损最为严重，使酸洗过程中样品大量流失，导致ADF测定值出现异常。3个无纺布及400目的聚酯布和400目的尼龙布处理未出现滤袋破损现象。

表2 不同材质滤袋的破损率Table 2 Damaged rates of filter-bags during ADF determination procedure

3 讨论

3.1 粉碎细度和滤袋对NDF和ADF含量的影响

范氏法测定NDF和ADF含量是利用中性洗涤剂和酸性洗涤剂分解植物细胞内容物(如脂肪、淀粉、蛋白质和糖类等)来实现的，洗涤和过滤是测定NDF和ADF含量的两个重要环节[1,12]。本试验结果显示，饲草样品经18目和40目粉碎处理，NDF含量显著低于9目处理(P<0.05)，表明样品细粉有利于非纤维物质的洗涤。钱文熙[13]对新鲜苜蓿、青贮玉米、棉籽壳(Cotton seed hull)和大豆(Soybean)的研究也发现，样品经18目、40目和60目(0.25 mm)处理CF含量低于8目(2.00 mm)处理，且测定结果重复性好，原因是细粉确保了试验样品的代表性，并有效扩大样品与试验试剂的接触面积，能促进非纤维物质的洗涤。

滤袋是滤袋法测定NDF和ADF技术的重要环节，其材质和孔径大小对测定结果的准确性影响很大。Lindberg 和 Knutsson[14]试验结果显示， 10 μm尼龙袋中装入18目粗饲料样品，水浸泡6 h后，干物质流失比例变动范围为3.7%～8.5%，显著低于20 μm尼龙袋。Ankom 技术认为[8]，F57滤袋将有少于5%的样品微粒(细度<30 μm)在洗涤中流失，田雨佳等[6]试验表明，这种流失导致了细粉处理(过40目网筛)的NDF和ADF含量较粗粉(过2.00 mm网筛)处理显著降低(P<0.05)，但试验并未给出滤袋孔径大小参数。Van miellen和 Ellis[15]研究认为，孔径为10 μm的滤袋能阻止样品流失。本试验数据显示，采用孔径为10 μm 的F58滤袋，饲草样品粉碎细度从9目增加至40目，微粒流失率变化范围为1.37%～1.86%，各处理间差异不显著。显然，与F57滤袋比，更小孔径的F58滤袋有效防止样品微粒的流失。

Komarek(1993)[16]和Komarek等(1994)[17]研究显示，滤袋法测定NDF和ADF含量与传统抽滤法的差异小于2%。Vogel等[8]和薛红枫等[9]研究显示，粉碎细度为18目的粗饲料样品用ANKOM公司F57滤袋测定NDF 和ADF含量，其测定值与传统抽滤法差异不显著。本研究采用ANKOM 公司提供的F58滤袋，孔径为10 μm，加上材料本身的三维结构，能有效降低样品微粒的流失，并畅通洗涤液在滤袋内外的流动，用于测定18目和40目粉碎处理的样品，两者的NDF和ADF含量一致。考虑到国标法测定粗蛋白等营养指标要求样品粉碎细度为40目，为减少样品粉碎次数，建议用孔径为10 μm 的三维无纺布纤维滤袋测定饲草中NDF和ADF含量时，样品粉碎细度可为40目。

3.2 适宜滤袋的筛选

滤袋法测定NDF和ADF含量过程中，滤袋充当了过滤膜的作用，要求其材质具备不易吸水、经酸碱和有机溶剂处理前后质量变化小的特点，并且孔径大小合适，保证洗涤剂的自由流通[11,18]。自上个世纪30年代以来，国内外学者对丝绸[19]、聚酯纤维[11]、尼龙布[7,10]和特制三维无纺布[7]等材质的筛选做了大量有益的探索，目前国内市场流通产品主要是ANKOM 公司的纤维滤袋和中国农业大学肉牛研究中心的CAU滤袋，材质均为特制无纺布。本研究结果显示，用CAU滤袋测定样品NDF和ADF含量与ANKOM F58滤袋差异不显著，这与薛红枫等[9]和王晓娜等[20]的研究结果一致。表明，CAU滤袋可以在饲草样品中替代ANKOM F58滤袋使用，以降低检测成本。

而普通无纺布、聚酯纤维与尼龙布滤袋NDF测定值均显著低于ANKOM F58滤袋，这与袁翠林等[10]和张崇玉等[11]研究结果不一致。究其原因，一是可能与试验样品粉碎细度不同有关。袁翠林等[10]和张崇玉等[11]的试验样品粉碎细度为18目，而本试验样品粉碎细度为40目。二是与滤袋材质和孔径有关。与400目尼龙布滤袋[10]和460目聚酯纤维滤袋[11]比较，ANKOM F58滤袋孔径更小，且具备三维结构，在畅通洗涤液出入滤袋膜、确保洗涤充分的同时，能更有效阻止样品细小微粒的流失。本试验用连续法测定样品ADF含量过程中，聚酯布和尼龙布滤袋破损现象普遍，均是封口内缘断裂，导致ADF含量偏低。这可能与本试验的滤袋缝制和封口方法有关，表明热封口方法不适合聚酯布和尼龙布滤袋制作。聚酯纤维与尼龙布滤袋在NDF和ADF测定中的应用还有待于对缝制方法、孔径大小及适宜样品粉碎细度上做进一步研究。