补肾活血化痰开窍方对耳鸣大鼠耳蜗螺旋神经节神经元5-HT1B、2C受体表达的影响△

孙勤国 罗蒙 江波 郭乃燕 张贤梅 徐鸿婕 牟艳杰 吕琨 杨倩

5羟色胺(serotonin,5-HT)又名血清素，其作为神经递质主要存在于松果体与下丘脑中，对机体许多生理功能包括痛觉、睡眠、体温等起重要作用；5-HT作为兴奋性的神经递质，可以促进动脉血管收缩以及血小板聚集，在抑郁发病过程中起重要作用[1],而抑郁与耳鸣呈相互递进关系[2]；5-HT的神经元胞体虽然位于听觉系统以外，但是其神经纤维末梢广泛存在于中枢神经系统的大部分听觉核团，比如：下丘、耳蜗核、上橄榄复合体等，对声音主要起调节作用。已有研究证实耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neuron，SGN)上存在多种5-HT受体亚型，其中包括5-HT1B、2C受体[3，4]，而目前研究最为广泛的是5-HT1A受体对于听觉通路的影响，而5-HT1B、2C鲜少提及。本研究前期进行了大量的临床研究工作，发现补肾活血化痰方联合针刺翳风穴能够有效的缓解老年性神经性耳鸣患者的症状[5]，初步的建立了耳鸣患者以“多虚多瘀”为中心的病理病机理论。虽然有多种方法可以用于耳鸣动物造模，但目前研究最多、最为稳定的是以噪声及耳毒性药物诱发耳鸣，并且该造模方法不仅可以检测是否成功诱发耳鸣，而且还可以研究药物治疗耳鸣的疗效、耳鸣相关的神经生理学机制[6,7]。本研究拟通过改良Jastreboff[8]经典的“饮水抑制”法建立大鼠耳鸣模型，观察补肾活血化痰开窍方对耳鸣大鼠耳蜗SGN中5-HT1B、2C受体表达的影响，探讨其治疗耳鸣的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 健康SPF级雄性SD大鼠60只，体重250±50 g，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号SCXK(鄂)2015-0018；饲养于各频率声音均小于25 dB SPL的隔声动物房内，室温20 ℃左右，相对湿度50%～60%。60只大鼠随机分为正常组(生理盐水组)10只，耳鸣模型组50只，耳鸣模型组再分为：水杨酸钠组(10只)、低剂量中药组(10只，按体质量5.5 g/kg)、中剂量中药组(10只，按体质量11 g/kg)、高剂量中药组(10只，按体质量22 g/kg)及卡马西平组(10只)。

1.2实验药品、试剂及仪器 补肾活血化痰开窍方由熟地黄15 g、山茱萸12 g、桑椹子12 g、菟丝子12 g、郁金15 g、远志6 g、泽泻10 g、石菖蒲12 g、葛根12 g、丹参10 g、三七12 g、磁石30 g、蔓荆子10 g、蝉蜕6 g组成。以上药物均购于同仁医院中药房，经过中药传统方法浸润、煎煮、过滤、浓缩制成煎剂，按相当生药量5.5 g/kg、11 g/kg,22 g/kg体质量制成低、中、高剂量，真空包装，低温冷藏备用；卡马西平片(上海中西三雄药业有限公司)，水杨酸钠注射液(sigma公司)；生理盐水注射液(四川科伦药业股份有限公司)。试剂：HTR1B Antibody(Proteintech，货号22189-1-AP)；SR-2C (Q437) polyclonal antibody(bioworld，货号BS2766)；生物素化羊抗兔lgG(拓捷生物，货号BA1003)；DAB显色试剂盒(博士德生物，货号AR1022)。仪器：荧光显微镜(OLYMPUS)、成像系统(MicroPublisher)、移液枪(Thermo)。

1.3耳鸣动物造模方法 隔声室内适应性喂养1周，禁水2天，待动物体重均下降至原体重80%开始进行经典的“背景噪声停止-饮水减少”条件反射[4]，在条件反射训练前3小时，正常组给予2 ml生理盐水腹腔注射，其他各组均按350 mg/kg给予10%水杨酸钠溶液腹腔注射；注射完成后，各组大鼠放置于有背景白噪声(70 dB SPL)的隔声室内[华中科技大学同济医学院耳鼻喉科提供听力检测仪器使用诱发电位仪、扬声器(Tucker-Davis-Technologies,美国)、外置扬声器(飞利浦，中国)，功率放大器(TOMO，中国)]，噪声软件为consecutive white noise，声级器(TES-1351B，台湾泰仕)校对；每只大鼠每天训练一次，每次30分钟，训练中条件刺激是背景白噪声停止，分别于训练的第5、10、15、20、25分钟出现，每次持续1分钟，当背景噪声停止后，动物舔水即从饮水嘴处给予48 V电击[220 V变24、36、48 V，交流变直流变压器(上海天觉提供)、时控开关控制电流(乐青八开电器提供)]，使其将电击的非条件刺激与噪声停止的条件刺激结合起来，形成“背景噪声停止-饮水减少或停止”的条件反射；全程用DV摄像机拍摄，经相关软件处理后记录每只动物在背景白噪声关闭前后各1 min内的累计舔水时间，将背景噪声关闭前1 min的舔水时间记录为A，背景噪声关闭后1 min的舔水时间记录为B，用舔水抑制率R=B/(A+B)反映动物条件反射的建立；在训练前，大鼠的R值稳定在0.5左右，动物尚未建立条件反射;训练后，R值逐渐下降，当R值小于0.2时，说明大鼠条件反射建立成功。条件反射消退期(即声音停止后不进行电击)，R值如果渐渐回到0.5时，模型组与对照组反射消退时间具有差异性则造模成功。

1.4耳鸣造模成功后各组给药方法 正常组(生理盐水组)及水杨酸钠组分别给予2 ml生理盐水灌胃，中药低、中、高剂量组按大鼠体重1 ml/100 g分别给予低(5.5 g/kg)、中(11 g/kg)、高(22 g/kg)剂量中药灌胃；卡马西平组按5 mg/kg生理盐水稀释后给予卡马西平2 ml灌胃，均为每天一次，各组持续给药8周，造模期间只在条件训练期30分钟内及造模成功后给水，不禁食。

1.5耳蜗取材 动物造模成功后给药至第8周，最后一次给药后3小时各组行耳蜗取材，整个过程在冰上操作，以10%水合氯醛(5 ml/kg)腹腔注射麻醉动物后，断头取脑，取双侧颞骨放入PBS平衡液中，在体视显微镜下打开听泡去除骨性耳蜗部分，分离螺旋韧带、血管纹、基底膜等组织，从蜗轴分离蜗螺旋管，获取SGN的组织块。

1.6免疫组化法检测耳蜗SGN的5-HT1B、2C受体的表达 将耳蜗石蜡切片置60 ℃干燥箱预温10分钟，脱蜡5～10分钟，以蒸馏水浸洗3～5遍，洗去残留乙醇，灭活内源性过氧化物酶后微波抗原修复，将切片浸泡在0.01 M、pH9.0 Tris-EDTA抗原修复液中，微波炉中火加热至沸腾，低火保持2分钟，5分钟后再低火加热5 min。待自然冷却后封闭，在每张切片上滴加50 μl适当稀释一抗，37 ℃孵育2小时，PBS洗3分钟×3次后孵育二抗，每张切片滴加50 μl生物素标记羊抗鼠IgG工作液，37 ℃孵育30分钟。PBS洗3分钟×3次。孵育SABC，配制DAB显色液，按购自博士德的DAB显色试剂盒(AR1022)说明书配制，预先配制好的DAB显色液，室温显色。复染，封片，显微镜下观察并拍照。

1.7统计学方法 应用SPSS 22.0统计学软件对数据进行统计学分析，正态分布的计量资料两两比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1耳鸣动物造模结果 60只大鼠中，10只为正常对照组，实验期间死亡1只；50只耳鸣模型组大鼠中，44只造模成功，其中6只因死亡及顺应性差造模不成功淘汰，造模成功率为88%(44/50)。与正常组相比，水杨酸钠组消退期明显缩短(表1，t=-20.42,P<0.01)，说明大鼠很有可能将水杨酸钠引起的耳鸣与背景声音混淆，从而其消退期当背景声音消失后比生理盐水组更加积极的饮水，对寂静环境的恐惧消除的更快，其他组均与正常组比较消退期有所缩短，且差异均有统计学意义(均为P<0.01),证明耳鸣动物造模成功。

表1 各组大鼠条件反射平均消退期比较(天，±s)

注：*与正常组比较，P<0.05

2.2各组耳蜗SGN中5-HT1B、2C受体表达比较 各组耳蜗螺旋神经元胞浆内均显示明显棕色阳性信号，表明5-HT1B、2C受体均存在于耳蜗螺旋神经节神经元内；与正常组比较，水杨酸钠组5-HT1B受体表达明显减少(图1)；与水杨酸钠组比较，卡马西平组及各中药组尤其是中剂量组5-HT1B受体表达明显增多；与正常组比较，水杨酸钠组5-HT2C受体表达明显增多；与水杨酸钠组比较，卡马西平组及各中药组尤其是中剂量组5-HT2C受体表达明显减少(图2)。

3 讨论

耳鸣作为一种严重影响人们身心健康的临床症状，表现为无外界刺激下个体主观感受到的声音感觉，其发病机制可能是多因素作用，导致听觉系统的抑制与兴奋平衡被破坏，造成异常刺激对耳蜗结构的破坏、听觉传导途径的神经纤维异常放电、听皮层超微结构的改变及功能重组致听觉中枢可塑性变化等[9,10]，其中，听觉通路神经递质及其受体一直被广泛关注，例如：谷氨酸受体(包括NMDA受体及非NMDA受体)、γ-氨基丁酸(GABA)及其受体、多巴胺及其受体、乙酰胆碱及其受体、P物质、5-HT及其受体等[11]。根据受体的氨基酸序列、药理学特性及细胞内信号转导机制，5-HT分为7种类型，即5-HT1～7受体，5-HT1B受体主要存在基底核、纹状路和前脑，5-HT1B受体激动剂激活突触前受体和突触后受体后能促进5-HT神经元放电，进而增强神经末梢5-HT的合成、转运及释放，因此，5-HT1B受体在5-HT系统中发挥重要的调节作用[12]；5-HT2C是迄今为止由RNA修饰来调节的G蛋白偶联受体，其RNA编辑对其功能影响重大，包括对情感、认知、焦虑等的调节，并参与精神障碍疾病发病的过程[13]；而耳鸣与情感、焦虑又密不可分，许多国际性耳鸣调查问卷，如：耳鸣残疾评估量表(tinnitus handicap inventory,THI)等多侧重于情感评估，一项对慢性耳鸣患者采用复合性国际诊断问卷调查的临床研究[14]结果显示，约半数的慢性耳鸣患者伴有心理障碍，其中包括情感障碍、焦虑及躯体形式障碍等。许多研究证实5-HT1B、2C受体在耳鸣的发病过程中影响重大，Hurley等[15]认为下丘神经元中突触前5-HT 1B受体能下调γ-GABAa受体介导的抑制作用，导致一些神经元诱发活动水平提高；而激活GABAa受体可在一定程度上减轻谷氨酸兴奋所致的耳蜗听功能损伤[16]；姚晨等[17]研究水杨酸钠致耳毒性时,对SGN上GABAa受体的作用机制分析也发现其亚单位mRNA的改变；柳玉芳等[18]提出伴有5-HT2C受体缺失的遗传突变可增加小鼠对声刺激所致癫痫的敏感性，而药物5-HT7可防止该效应，认为5-HT2A和2C受体功能改变的遗传多态现象与Alzheimer病的听觉反应的改变有关；上述研究均提示5-HT特别是5-HT2C在神经网络兴奋性中的重要作用，认为很多抗精神类药物，如利司呱酮(risperidone)和奥氮平(olanzapine)，除了常规的多巴胺拮抗剂作用外，还具有独特的5-HT2受体拮抗剂功能,这些药物也能用于耳鸣的治疗，而卡马西平通过抑制神经元的异常放电、镇静催眠，多方面缓解患者神经症状及情绪，成为治疗耳鸣的一线用药，故本研究选用卡马西平作为治疗耳鸣的西药对比。

耳鸣的发生与内耳缺血缺氧、微循环障碍有关[19]，从非听觉系统来看则与情感、记忆与情绪特别是负面情绪有关[20]。研究显示熟地黄、泽泻能够明显抑制GM诱导毛细胞区域凋亡标志酶Caspase-3、Caspase-9的激活，上调BcL2/Bax蛋白表达比值，从而减轻毛细胞凋亡[21]；葛根总黄酮有扩张脑及内耳血管，调节毛细胞代谢[22]作用；山茱萸多糖通过改善骨髓造血，促进各种血细胞的恢复[23]；石菖蒲、蝉蜕、磁石均具有抑制中枢神经系统、镇惊、抗惊厥作用，其中石菖蒲发挥油和水煎剂可能提高中枢GABA含量，降低Glu和5-HT从而起到抗焦虑作用[24]；蝉蜕醇提取物和水提物均可延长小鼠发生惊厥的潜伏期和延长惊厥小鼠死亡时间[25]；而磁石中含有大量的铁元素，而低铁可能会使耳蜗处细胞膜过氧化，导致听神经损伤[26]；丹参的主要成分为丹参酮类化合物、三七的主要活性成分为皂苷，蔓荆子的果实中含有多种挥发油，这些物质均具有抗氧化，改善微循环作用，从而增加内耳的血运及含氧量，减少耳鸣的发生[27]。本研究选用的补肾活血化痰开窍方，方中以熟地黄为君药，滋阴养血，补肾填精；臣以山茱萸补益肝肾，桑椹子滋阴补血，菟丝子补肝肾，益精髓；佐以郁金行气解郁，凉血破瘀；远志安神益智、祛痰，泽泻配熟地黄泻肾浊消肿；石菖蒲化痰开窍、化湿行气；配葛根、丹参、三七活血化瘀通络；磁石平肝潜阳、补肾益阴、聪耳明目；蔓荆子、蝉蜕疏风清热，并以其疏散之性，使诸药补而不滞；诸药配合，共奏补肾活血、祛痰开窍之功。从文中结果看，水杨酸钠组的5-HT1B受体表达较生理盐水组明显减少，5-HT2C受体则明显增多；与既往的研究[28,29]一致，而卡马西平组及低、中、高剂量补肾活血化痰开窍方各组的5-HT1B受体表达增加，5-HT2C受体减少，可能改变了水杨酸钠致大鼠耳鸣相关的受体激活致耳鸣减弱或消失，故该方可应用于耳鸣的治疗。但本实验的样本含量较少，缺乏多元化比较分析，补肾活血化痰开窍方治疗耳鸣的机制繁多，仍需进一步探讨。