福建省606例非综合征型聋患者常见聋病基因突变检测结果分析*

林文津 郭舜民 徐小妹 徐榕青 张亚敏 李丽莎 卢雪花

根据第二次全国残疾人抽样调查结果，2006年福建省残联统计数据分析报告显示，福建省各类残疾人总数为221.1万人，占总人口的6.25%，其中听力残疾61.3万人，占27.73%，是目前福建省残疾人人数及比重最多的人群。目前听力残疾尚无特效治疗方法，但遗传性耳聋基因检测可为部分耳聋患者找到病因。目前基因检测的方法有多种，包括毛细管电泳测序法[1]、基因芯片法[2]、荧光定量PCR法[1]、高通量测序法[3]、飞行时间质谱法[4]等。本研究采用飞行时间质谱技术结合传统的毛细管电泳测序技术，对福建省福州、龙岩、南平、三明地区部分非综合征型聋患者的GJB2、SLC26A4、12SrRNA、GJB3 4个基因共20个常见突变位点进行检测，以探讨福建省聋病患者常见突变基因及突变热点，为福建省开展聋病患者优生优育及个体化用药的遗传咨询、基因诊断和预防干预提供参考。

1 资料与方法

1.1研究对象 2014年12月～2017年12月在福建省福州(190例，男92，女68)、龙岩(134例，男77，女57)、南平(132例，男67，女65)、三明市(150例，男76，女74)聋哑学校收集非综合征型聋患者606例，其中籍贯为福州的130例，龙岩148例，三明150例，南平134例，宁德18例，泉州13例，莆田8例，漳州3例，厦门2例；汉族594例，畲族6例，满族3例，土家族2例，苗族1例；年龄1～55岁，听力损失程度为轻度105例，中度81例，重度246例，极重度174例；语前聋362例，语后聋244例。本研究经福建省医学科学研究院医学伦理委员会同意认可，研究资料及临床标本的采集均获得了患者本人及家属的知情同意，签署了知情同意书，并填写了患者基本信息登记表以便详细了解患者病史。

1.2研究方法

1.2.1仪器与试剂 Mass ARRAY DNA质谱阵列基因分析系统(美国 Sequenom 公司)、QIAcube核酸纯化仪(QIAGEN公司)、超微量蛋白核酸分析仪(英国Biodrop公司)、PCR仪(Bio-Rad 公司)、ABI3730 测序仪、QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN公司)，Taq PCR Mastermix(天根公司)，引物序列采用Sequenom 公司提供的软件Mass ARRAY Assay Design参考文献设计，引物合成由铂尚生物技术(上海)有限公司完成。

1.2.2全血基因组DNA的提取 采集所有受检者的外周静脉血约2 ml，EDTA抗凝，参照QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒的使用说明书进行，提取得受检者全血基因组DNA100 μl，应用超微量分光光度计检测提取得到的患者基因组DNA浓度与纯度，并用琼脂糖凝胶电泳检测基因组完整性，冻存在-80 ℃超低温冰箱中备用。

1.2.3PCR扩增 取试剂盒中扩增反应液mix 12.5 μl，加入扩增引物各1 μl，DNA模板加入2 μl，最后加水至25 μl，然后上机进行PCR扩增。温度循环程序为： 94 ℃、5 min，1个循环； 94 ℃、45 s，55 ℃～60 ℃、1 min，72 ℃、45 s，30个循环； 72 ℃、5 min，1个循环。

1.2.4耳聋基因突变检测 飞行时间质谱检测：将上述扩增产物经虾碱式磷酸酶消化、延伸引物单碱基延伸、阳离子消化树脂纯化后用质谱仪按照仪器操作说明书进行。检测的基因及位点：12SrRNA基因1555A→G、1494C→T，GJB2基因35del G、167del T、176_191del 16、235del C、299_300del AT，SLC26A4基因281C→T、589G→A、IVS7-2 A→G、1174A→T、1226G→A、1229C→T、IVS15+5 G→A、1975GC、2027T→A、2162C→T、2168A→G，GJB3基因538C→T、547G→A。

毛细管电泳测序验证：参考文献采用的常规方法[5]制备成测序模板后，用传统毛细管电泳测序法在ABI3730 测序仪上对GJB2编码区序列和SLC26A4 21个外显子序列测序验证。

1.3统计学方法 采用SPSS18.0统计软件对数据进行统计学分析，不同地区非综合征型聋患者组间基因突变检出数两两比较采用χ2检验。

2 结果

606例非综合征型聋患者中共检测出耳聋基因突变140例(23.10%，140/606)，其中12SrRNA 基因突变40例(6.60%,40/606，主要集中在3个家系)，GJB2耳聋基因突变67例(11.06%,67/606)，SLC26A4突变患者33例(5.54%,33/606)，未检出GJB3基因突变。毛细管电泳测序验证了飞行时间质谱检测结果，但测序也发现了一些较不常见的突变位点，如GJB2基因511_512insAACG(4例)，257C→G(1例)，SLC26A4 基因754T→C(2例)、Exon1_Exon3Del(2例)、1686_1687insA(1例)、1079C→T (1例)、1707+5G→A(1例)、1646insA(1例)突变，这些位点纯合突变或复合杂合突变也会致聋。606例非综合征型聋患者基因检测结果见表1、2，可见，除南平地区基因突变检出率高于福州地区，差异有统计学意义(P<0.05)外，其他地区间检出率差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 福建不同地区非综合征型聋患者12SrRNA、GJB2、SLC26A4基因突变检出例数及检出率(例)

表2 140例非综合征型聋患者基因突变位点、突变类型及检出例数(例)

注：*该突变不属于20个常见突变位点，采用传统毛细管电泳测序法检出。

3 讨论

本研究通过对福建省福州市、龙岩市、南平市、三明市四个地区非综合征型聋患者四个常见耳聋基因12SrRNA、GJB2、SLC26A4、GJB3基因20个常见突变位点检测分析，可以为23.10%的患者找到耳聋分子病因，略低于文献[6]报道的福州地区听力障碍者常见耳聋基因突变筛查结果(26.14%)；其中龙岩市、南平市、三明市非综合征型聋患者GJB2的突变检出率最高，福州市12SrRNA突变检出率最高，龙岩市12SrRNA突变检出率最低，可能与12SrRNA突变为母系遗传，入选病例易出现家族聚集特征有关。本研究福州地区12SrRNA突变患者主要集中在3个家系，龙岩地区12SrRNA突变较低可能与无大家系入选有关。

GJB2基因突变导致的耳聋，一般为双耳同时受累，听力损失程度呈对称性，少数表现为不对称性，也有单耳受损报道。绝大多数GJB2基因突变致聋患者表现为先天性重度感音神经性聋，高频听力或低高频听力同时受损，可以排除其他神经系统疾病，提示耳蜗受损部位主要位于耳蜗基底膜的蜗底及蜗顶区域，这对人工耳蜗电极的植入位置有参考价值[7]。本研究结果显示，福建省606例非综合征型聋患者主要检出突变基因为GJB2基因，其235delC突变位点检出率最高，与文献报道的华北地区[8]、滕州地区[9]聋病患者、北京地区新生儿[10]检测结果一致。但个别位点，如：511_512insAACG采用20个位点的飞行时间质谱方法不能检出，需要结合毛细管电泳测序法对GJB2编码区序列测序验证。

大前庭水管综合征常合并耳蜗和/或半规管畸形，如：耳蜗畸形、前庭池扩大、半规管壶腹扩大等。SLC26A4基因突变与大前庭水管综合征和耳蜗畸形有非常密切的关系，其导致的听力下降呈进行性或波动性，轻度头部外伤即可能诱发。确诊SLC26A4基因突变的患者，可制定一套相应的生活和治疗指导方案，避免剧烈运动、头部碰撞，以延缓听力损失的发生或缓解病情[11]。本研究结果显示，福建省606例非综合征型聋患者SLC26A4基因突变位点主要是IVS7-2 A→G，与浙江省大前庭水管综合征患者检测结果一致[12]；本研究还发现另外6个较不常见的突变位点，如：754T→C、Exon1_Exon3Del、1686_1687insA、1079C→T、1707+5G→A、1646insA位点，采用20个位点的飞行时间质谱方法不能检出，建议同时进行CT检查以排除大前庭水管综合征。

携带线粒体12SrRNA基因1555A→G或1494C→T位点突变的个体是氨基糖苷类抗生素等耳毒性药物的敏感个体，对氨基糖苷类抗生素高度敏感，小剂量应用即可造成重度听力损失，其耳聋的发生与用药直接相关，主要临床表现为耳聋、耳鸣、眩晕及平衡障碍，还可出现食欲减退、面部及手足麻木等症状。通过基因检测，及早发现该基因突变携带者，及早对其进行干预，可有效预防药物性聋的发生[5]。本研究结果显示，福建省不同地区非综合征型聋患者中均检出了12SrRNA基因1555A→G突变，部分地区还有散发的12SrRNA基因1494C→T突变，建议在进行新生儿听力筛查的同时，应开展药物性聋相关基因突变筛查。

GJB3基因突变可以引起常染色体显性和隐性遗传非综合征型聋，常与高频听力下降有关，其常见突变位点为C538T、G547A[13]；本研究606例非综合征型聋患者中未检出GJB3基因突变，可能与福建省该基因突变率较低有关。

(致谢：感谢福建省残联杨殷秘书长、福州市、龙岩市、南平市、三明市聋哑学校老师、深圳华大基因在耳聋基因检测过程中给予的帮助与支持。)